• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá)的影響*

    2017-11-01 09:20:07莫選榮謝江文呂國菊柯于平羅心靜
    關(guān)鍵詞:滑膜活化克隆

    莫選榮, 謝江文, 呂國菊, 柯于平, 羅心靜△

    (1. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部, 浙江 臺州 318000; 2. 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院心內(nèi)科, 浙江 寧波 315000)

    TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá)的影響*

    莫選榮1, 謝江文2, 呂國菊2, 柯于平1, 羅心靜1△

    (1. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部, 浙江 臺州 318000; 2. 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院心內(nèi)科, 浙江 寧波 315000)

    目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TAK1)基因沉默對腫瘤壞死因子a(TNF-a)誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞中促炎介質(zhì)白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)表達(dá)的影響,以探討TAK1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病中的作用。方法采取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將TAK1特異性的小干擾RNA(siRNA)和陰性對照RNA(scRNA)導(dǎo)入類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜成纖維細(xì)胞株MH7A細(xì)胞,然后分別用20 ng/ml TNF-a刺激后,檢測細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)和培養(yǎng)上清中IL-6和IL-8分泌情況以及p38、ERK、JNK、p65磷酸化的水平和抑制性蛋白IκBα的變化情況。結(jié)果siRNA-TAK1轉(zhuǎn)染72 h后滑膜細(xì)胞中TAK mRNA和蛋白表達(dá)的平均抑制率分別為75%和55%。siRNA-TAK1轉(zhuǎn)染下調(diào)TNF-a誘導(dǎo)狀態(tài)下IL-6和IL-8的表達(dá),并能抑制p38、JNK、p65磷酸化和增加IκBα水平。結(jié)論TAK1基因沉默能抑制TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá),可能與其抑制JNK和p38MAPK的活化及NF-κB的活化有關(guān)。

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;滑膜細(xì)胞;炎癥介質(zhì);TAK1

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性自身免疫性疾病。關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞在滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞中起重要作用,被認(rèn)為是治療RA的關(guān)鍵靶細(xì)胞[1]。研究表明,滑膜成纖維細(xì)胞被炎癥細(xì)胞因子IL-1和TNF-a激活后合成和分泌促炎介質(zhì)IL-6、IL-8和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP),

    使RA炎癥反應(yīng)持續(xù)存在并加重關(guān)節(jié)破壞。而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPKs)和核因子-κB(nuclear factor- kappa B,NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RA炎癥介質(zhì)過度表達(dá)中發(fā)揮重要作用[2-4]。

    轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activating kinase 1,TAK1)屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK)家族成員之一,能被多種促炎細(xì)胞介質(zhì)包括TNF-a、IL-1和LPS激活?;罨腡AK1通過激活MAPKK3/6(MKK3/6)導(dǎo)致MAPK途徑及NF-κB途徑活化而參與炎癥、免疫反應(yīng)等病理生理過程[5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn),在RA患者滑膜組織及促炎介質(zhì)誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞中TAK1表達(dá)顯著升高[6, 7],但其在RA病變中的作用及機(jī)制至今仍未闡明。

    本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)阻遏RA滑膜成纖維細(xì)胞中TAK1的表達(dá),觀察TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的IL-6、IL-8表達(dá)的影響,并探討其可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞株MH7A(日本)購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

    1.2 主要試劑

    兔抗TAK1多克隆抗體(美國Abcam公司);兔抗p-P38多克隆抗體、兔抗p-JNK多克隆抗體、兔抗p-ERK多克隆抗體、兔抗p-p65多克隆抗體、兔抗IκBα多克隆抗體(均購于美國Cell signaling公司);兔抗GAPDH單克隆抗兔(美國Santa cruz公司);羊抗兔Ig(美國Santa cruz公司);PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光液(美國Millipore公司);IL-6和IL-8 ELISA試劑盒(美國RD公司);power SYBR green PCR master mix (美國Applied Biosystems);first strand cDNA synthesis kit (美國Thermo scientific公司);Trizol reagent (美國Invitrogen公司);Lipofectamine RNAimax (美國Invitrogen公司);胎牛血清(美國Life Technologies公司);DMEM(美國Life Technologies公司);重組TNF-a蛋白(美國RD公司);TAK1小干擾RNA(siRNA)序列及陰性對照ScRNA序列由上海吉瑪公司合成;TAK1siRNA,正義鏈為5’GGACAUUGCUUCUA CAAAU3’,反義鏈為5’GAGUGAAUCUGGA CGUUUA3’.定量PCR引物TAK1、IL-6、IL-8和GAPDH引物由上海捷瑞生物公司合成(表1)。

    Tab. 1 Human primers used for quantitative PCR

    1.3 滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

    將MH7A滑膜成纖維細(xì)胞株用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時,用0.25%胰酶消化并接種于6孔板,實驗分為6組,正常對照組(ctrl)、TAK1 siRNA轉(zhuǎn)染組(siTAK1)、陰性siRNA轉(zhuǎn)染組(scRNA)、單純TNF-a組(TNF)、TAK1 siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-a組(siTAK1+TNF)、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-a組(sc+TNF)。每組細(xì)胞數(shù)接種3復(fù)孔,每孔細(xì)胞數(shù)為5×105。室溫下將20 nmol/L TAK1 siRNA或scRNA RNAiMax混合物分別轉(zhuǎn)染siTAK1組、siTAK1+TNF組和scRNA組、sc+TNF組滑膜細(xì)胞。于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育后72 h換液,ctrl組、siTAK1組和scRNA組換為含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液,TNF組、siTAK1+TNF組、sc+TNF組換為終濃度為20 ng/ml的TNF-a培養(yǎng)基。37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h,分別收集細(xì)胞或上清用于 IL-6和IL-8 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)分析。

    1.4 TAK1 siRNA轉(zhuǎn)染

    按照Lipofectamine RNAiMax試劑盒的操作說明進(jìn)行,將20 nmol/L TAK1 siRNA或ScRNA和RNAiMax混合物轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞,分別用定量PCR和Western blot檢測抑制效果。

    1.5熒光定量PCR法檢測IL-6和IL-8mRNA的表達(dá)

    滑膜細(xì)胞經(jīng)TNF-a處理4 h后,收集細(xì)胞,采用Trizon法提取總RNA。按cDNA合成試劑盒的操作說明,將RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)總體積為20 μl,包括10 μl power SYBR green PCR master mix, 100 ng cDNA and 0.2 mol/L 正義和反義引物。循環(huán)參數(shù):95℃ 5 min預(yù)變性,95℃變性1 min,60℃復(fù)性和延伸30 s,共40個循環(huán)。最后72℃延伸5 min。GAPDH作為內(nèi)參對照,定量采用比較Ct 法 (2-ΔΔCt)。

    1.6Westernblot法檢測磷酸化P38、JNK、ERK及p65、IκBα蛋白的表達(dá)

    滑膜細(xì)胞經(jīng)TNF-a處理15 min后,收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min,高速離心,收集蛋白上清。采用BCA法測定蛋白濃度,取20~30 μg蛋白上清與上樣緩沖液混合,100℃煮沸10 min,樣本經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后,采用濕轉(zhuǎn)法(380 mA,50~60 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜浸入含有5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫封閉2 h。然后加入羊抗兔TAK1抗體(1:1 000)、羊抗兔p-P38抗體(1:1 000)、兔抗p-JNK多克隆抗體(1:1 000)、兔抗p-ERK多克隆抗體(1:1 000)、兔抗p-p65多克隆抗體(1:1 000)、兔抗IκBα多克隆抗體(1:500)、羊抗兔GAPDH抗體(1:1 000)等,4℃孵育過夜,漂洗后,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig (1:5 000),反應(yīng)1 h。ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測膜上的抗原-抗體復(fù)合物, 置凝膠成像系統(tǒng)成像,灰度分析。GAPDH為內(nèi)參照物。

    1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

    TNF-a處理滑膜細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測上清中IL-6和IL-8,具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 TAK1基因沉默效果的評價

    熒光定量PCR結(jié)果顯示,與未處理的滑膜細(xì)胞相比,siRNA TAK1轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞48~72 h后TAK1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞TAK1 mRNA表達(dá)量與未處理細(xì)胞相比則無顯著差異。siRNA轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞72 h時TAK1 mRNA表達(dá)抑制效果最佳,平均抑制效率為75%(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示,siRNA TAK1轉(zhuǎn)染48~72 h后滑膜細(xì)胞TAK1蛋白表達(dá)量與正常對照相比顯著降低(P<0.05),而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞TAK1 蛋白表達(dá)量與正常細(xì)胞相比則無顯著差異。siRNA轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞72 h時TAK1蛋白平均抑制效率為55%(圖1B)。

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells,were left untreated (Ctrl) or transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for the indicated times. The expression of TAK1 mRNA and protein was assessed by real-time PCR (A) and by Western blot (B) respectively

    *P<0.05vsthe untreated cells (Ctrl)

    2.2 TAK1基因沉默對IL-6和IL-8表達(dá)的影響

    熒光定量PCR結(jié)果顯示,與未處理的正常細(xì)胞相比,基礎(chǔ)狀態(tài)時siRNA TAK1轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)呈下降趨勢,但并沒有顯著性差異。TNF-a刺激4 h時,IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)明顯升高。siRNA轉(zhuǎn)染能顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)與正常細(xì)胞相比則無顯著差異(圖2A、2C)。ELISA實驗顯示,TNF-a 刺激24 h時,滑膜細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8明顯升高。siRNA轉(zhuǎn)染顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6和IL-8蛋白的生成和分泌(P<0.05)。而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8與正常細(xì)胞相比則無顯著差異(圖2B、2D)。

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells, were transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for 72 h, then incubated with TNF-α (20 ng/ml) for 4 h or 24 h. IL-6 (A, B) and IL-8 (C, D) expression was assessed by real-time PCR and ELISA)

    *P<0.05vsthe untreated cells (Ctrl);#P<0.05vsTNF-α group

    2.3 TAK1基因沉默對MAPK活化的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞相比,siRNA轉(zhuǎn)染能顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的P38和JNK的磷酸化,對TNF-a誘導(dǎo)的ERK的磷酸化無顯著影響(圖3)。

    2.4 TAK1基因沉默對NF-kB活化的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞相比, siRNA TAK1轉(zhuǎn)染能顯著抑制基礎(chǔ)狀態(tài)或TNF-a刺激下滑膜細(xì)胞p65的磷酸化,并且能上調(diào) IκBa 的表達(dá)(圖4)。

    3 討論

    實驗關(guān)節(jié)炎動物和臨床患者關(guān)節(jié)炎的研究表明,滑膜成纖維細(xì)胞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)關(guān)節(jié)滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞[8]?;こ衫w維細(xì)胞能被促炎細(xì)胞因子TNF-a、IL-1激活并合成和分泌促炎介質(zhì)。其中IL-6和IL-8是RA滑膜成纖維細(xì)胞合成和分泌的主要促炎介質(zhì)[9],在RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞中起到重要作用。IL-6被認(rèn)為是參與炎癥的重要細(xì)胞因子,它不僅能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和B淋巴細(xì)胞的分化,還能調(diào)節(jié)急性反應(yīng)期蛋白及其它炎癥介質(zhì)的生成,參與多種自身免疫性疾病,包括RA的病理過程。IL-8是重要的趨化因子,能趨化募集血液中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,在這些炎性細(xì)胞的滲出中起重要作用。RA患者的血漿和關(guān)節(jié)液中IL-6和IL-8水平顯著升高,并且與RA病變的活動性呈正相關(guān)[10]。RA患者或?qū)嶒炐躁P(guān)節(jié)炎大鼠實驗表明,封閉這些細(xì)胞因子及與其受體能顯著緩解病情進(jìn)展和減輕關(guān)節(jié)炎癥狀[11, 12]。我們和其他學(xué)者研究表明MAPKs和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了RA滑膜細(xì)胞中IL-6和IL-8生成的調(diào)節(jié)[3, 13,15]。

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells, were transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for 72 h, then incubated with TNF-α (20 ng/ml) for 15 min. The phosphorylation of P38,JNK and ERK was examined by Western blot

    *P<0.05

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells, were transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for 72 h, then incubated with TNF-α (20 ng/ml) for 15 min. The levels of p-p65 and nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells in hibitor, alpha(IκBa) was examined by Western blot

    *P<0.05

    TAK1作為MAPKKKs 家族成員之一,與免疫細(xì)胞胞質(zhì)中TAK1結(jié)合蛋白(TAK1-binding protein,TAB1/2)結(jié)合形成復(fù)合物,通過激活MAPKK3/6(MKK3/6)后,再進(jìn)一步激活P38、JNK和ERK等MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。近年來發(fā)現(xiàn)TAK1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織表達(dá)明顯升高,并且可能與實驗性關(guān)節(jié)炎病變進(jìn)展有關(guān)[6]。體外實驗表明,TAK1在IL-1誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,抑制其表達(dá)則顯著下調(diào)金屬蛋白酶3(MMP-3)和IL-6的表達(dá)[14]。我們應(yīng)用siRNA高效抑制滑膜細(xì)胞TAK1表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),TAK1基因沉默能抑制TNF-a誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的表達(dá),表明TNF-a通過TAK1誘導(dǎo)了IL-6和IL-8基因表達(dá)。我們研究提示TAK1可能參與滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8的過度表達(dá)而在RA發(fā)病中起重要作用。

    為了進(jìn)一步闡明TAK1調(diào)控炎癥因子的分子機(jī)制,我們檢測了TAK1對下游MAPK途徑信號分子P38,JNK和ERK活化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TAK1基因沉默滑膜細(xì)胞后TNF-a誘導(dǎo)的P38、JNK磷酸化水平明顯減少,而ERK磷酸化水平并沒有明顯改變,表明TAK1可能激活P38、JNK信號途徑調(diào)節(jié)TNF-a誘導(dǎo)的IL-6和IL-8表達(dá)。

    作為炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游重要的激酶,TAK1除了參與MAPK信號途徑的調(diào)節(jié)外,也參與NF-κB信號途徑的活化。NF-κB 是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子,一般是由p65和p50 亞單位組成的異源二聚體。在未激活狀態(tài)下, NF-κB 與抑制蛋白IκB 結(jié)合以無活性的形式存在于胞漿。當(dāng)細(xì)胞受炎癥介質(zhì)激活后解除 IκB 對NF-κB 的抑制作用,促進(jìn)NF-kB核易位,繼而激發(fā)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[16]。研究表明,TAK1與TAK1結(jié)合蛋白(TAB1)結(jié)合,激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)和IkB激酶(IKK),參與IL-1β激活的NF-κB活性的調(diào)節(jié)[5]。我們也觀察了TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞NF-κB途徑活化的影響。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞中TAK1表達(dá)阻遏后,NF-κB(p65)磷酸化水平降低,而抑制性蛋白IκBα的表達(dá)升高,這些結(jié)果表明TAK1基因沉默能抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB的活化。以上結(jié)果表明,TAK1參與滑膜細(xì)胞NF-κB途徑的活化調(diào)節(jié)而參與RA炎癥。

    總之,我們實驗結(jié)果表明TAK1參與TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8表達(dá)的調(diào)節(jié),其機(jī)制可能與其激活下游信號分子JNK、P38及NF-κB活化有關(guān),TAK1在RA滑膜炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中可能起重要調(diào)節(jié)作用,并可能作為RA治療中的一種新的靶點。我們下一步動物實驗將進(jìn)一步驗證TAK1基因沉默對實驗性關(guān)節(jié)炎動物滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞的影響。

    [1] Sato S, Sanjo H, Takeda K,etal. Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses[J].NatImmunol, 2005, 6(11): 1087-1095.

    [2] Meyer LH, Pap T. MAPK signalling in rheumatoid joint destruction: can we unravel the puzzle[J].ArthritisResTher, 2005, 7(5): 177-178.

    [3] Neff L, Zeisel M, Sibilia J,etal. NF-kappaB and the MAP kinases/AP-1 pathways are both involved in interleukin-6 and interleukin-8 expression in fibroblast-like synoviocytes stimulated by protein I/II, a modulin from oral streptococci[J].CellMicrobiol, 2001, 3(10): 703-712.

    [4] Hammaker D, Sweeney S, Firestein GS. Signal transduction networks in rheumatoid arthritis[J].AnnRheumDis, 2003, 62(Suppl 2): ii86-89.

    [5] Delaney JR, Mlodzik M. TGF-beta activated kinase-1: new insights into the diverse roles of TAK1 in development and immunity[J].CellCycle, 2006, 5(24): 2852-2855.

    [6] Geurts J, van den Brand BT, Wolf A,etal. Toll-like receptor 4 signalling is specifically TGF-beta-activated kinase 1 independent in synovial fibroblasts[J].Rheumatology(Oxford), 2011, 50(7): 1216-1225.

    [7] Hammaker DR, Boyle DL, Chabaud-Riou M,etal. Regulation of c-Jun N-terminal kinase by MEKK-2 and mitogen-activated protein kinase kinase kinases in rheumatoid arthritis[J].JImmunol, 2004, 172(3): 1612-1618.

    [8] Mor A, Abramson SB, Pillinger MH. The fibroblast-like synovial cell in rheumatoid arthritis: a key player in inflammation and joint destruction[J].ClinImmunol, 2005,115(2): 118-128.

    [9] Georganas C, Liu H, Perlman H,etal. Regulation of IL-6 and IL-8 expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts: the dominant role for NF-kappa B but not C/EBP beta or c-Jun[J].JImmunol, 2000, 165(12): 7199-7206.

    [10]Matsumoto T, Tsurumoto T, Shindo H. Interleukin-6 levels in synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis correlated with the infiltration of inflammatory cells in synovial membrane[J].RheumatolInt, 2006, 26(12): 1096-1100.

    [11]Hennigan S, Kavanaugh A. Interleukin-6 inhibitors in the treatment of rheumatoid arthritis[J].TherClinRiskManag, 2008, 4(4): 767-775.

    [12]Choy E. Inhibiting interleukin-6 in rheumatoid arthritis[J].CurrRheumatolRep, 2008, 10(5): 413-417.

    [13]Nanki T, Nagasaka K, Hayashida K,etal. Chemokines regulate IL-6 and IL-8 production by fibroblast-like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis[J].JImmunol, 2001, 167(9): 5381-5385.

    [14]Klatt AR, Klinger G, Neumuller O,etal. TAK1 downregulation reduces IL-1beta induced expression of MMP13, MMP1 and TNF-alpha[J].BiomedPharmacother, 2006, 60(2): 55-61.

    [15]羅心靜, 莫選榮, 周玲玲. Hsp72對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá)及NF-kB活化的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2012, 28(4): 336-339.

    [16]張國霞, 周愛玲, 張貴萍, 等. 大鼠海馬神經(jīng)元 TLR4 介導(dǎo)的 MyD88 依賴途徑在神經(jīng)炎癥中的作用[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(1): 42-46.

    EffectsofTAKgenesilencingontheexpressionsofIL-6andIL-8inducedbyTNF-αinfibroblast-likesynoviocytes

    MO Xuan-rong1, XIE Jiang-wen2, LV Guo-ju2, KE Yu-ping1, LUO Xin-jing1△

    (1. Department of Basic Medical Sciences, School of Medicine of Taizhou University, Taizhou 318000;2. Department of Cardiology, Yingzhou District Second people's Hospital, Ningbo 315000, China)

    Objective: To investigate the effects of silencing transforming growth factor-β activating kinase 1 (TAK1)on the expressions of IL-6 and IL-8 induced by TNF-α in fibroblast-like synoviocytes, and to explore the role of TAK1 in rheumatoid arthritis (RA).MethodsThe synthesized TAK1 siRNA and scrambled siRNA (ScRNA) were transferred into cultured RA fibroblast-like synoviocyte line MH7A by lipofectamine. The expressions of the pro-inflammatory mediator IL-6 and IL-8 and the levels of phospho-P38(p-P38), phospho-C-Jun NH2-terminal kinase(p-JNK), phospho-extracellular signal-regulated kinase(p-ERK), phospho-p65(p-p65) and nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha(IκBa) were examined.ResultsSilencing of TAK was demonstrated in synoviocytes transfected by TAK siRNA. TAK1 silencing markedly attenuated the expression of IL-6 and IL-8 in the presence of TNF-α. TAK1 silencing inhibited the activation of p38 and JNK MAPK. TAK1 silencing also inhibited activation of nuclear factor-κB (NF-κB).ConclusionTAK1 silencing attenuated the expression of IL-6 and IL-8 in synoviocytes induced by TNF-αviainhibiting the activation of p38, JNK MAPK and NF-κB.

    rheumatoid arthritis; synoviocytes; inflammatory mediators; TAK1

    R392.12

    A

    1000-6834(2017)05-471-05

    10.12047/j.cjap.5494.2017.113

    國家自然科學(xué)基金面上項目(81373139);浙江省自然科學(xué)基金(LY16H100001);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(2015KYA206)

    2016-09-09

    2017-05-12

    Tel: 15068647955; E-mail: luoxjing@126.com

    猜你喜歡
    滑膜活化克隆
    克隆狼
    無Sn-Pd活化法制備PANI/Cu導(dǎo)電織物
    基于滑膜控制的船舶永磁同步推進(jìn)電機(jī)直接轉(zhuǎn)矩控制研究
    高層建筑施工中的滑膜施工技術(shù)要點探討
    浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
    小學(xué)生活化寫作教學(xué)思考
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    滑膜肉瘤的研究進(jìn)展
    Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
    原發(fā)性肺滑膜肉瘤診斷與治療——附一例報告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    国产在线观看jvid| 高清在线国产一区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲午夜理论影院| 妹子高潮喷水视频| 成人国产一区最新在线观看| 久久人人精品亚洲av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 韩国av一区二区三区四区| 精品一区二区三区av网在线观看| www.www免费av| 好男人在线观看高清免费视频 | 女性被躁到高潮视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人精品无人区| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩欧美三级三区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲在线自拍视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产单亲对白刺激| 国产高清videossex| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲国产精品合色在线| 在线观看66精品国产| e午夜精品久久久久久久| 国产高清有码在线观看视频 | 免费观看人在逋| 大香蕉久久成人网| 婷婷丁香在线五月| 亚洲天堂国产精品一区在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产视频一区二区在线看| 看片在线看免费视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久热在线av| 在线观看免费视频日本深夜| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品国产乱码久久久久久男人| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲男人天堂网一区| avwww免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产欧美日韩精品亚洲av| videosex国产| 丝袜美腿诱惑在线| 日本免费a在线| 亚洲九九香蕉| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费看美女性在线毛片视频| 两个人视频免费观看高清| 国产av精品麻豆| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 韩国av一区二区三区四区| 成人国产综合亚洲| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| netflix在线观看网站| 精品福利观看| 一级a爱视频在线免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 久久中文看片网| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品在线美女| 亚洲国产看品久久| 十八禁网站免费在线| 在线观看免费视频网站a站| 免费看a级黄色片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日本 av在线| 18禁国产床啪视频网站| 午夜福利免费观看在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国内精品久久久久精免费| 久久人妻av系列| 校园春色视频在线观看| 亚洲在线自拍视频| 老司机在亚洲福利影院| 一二三四社区在线视频社区8| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲中文av在线| 久久香蕉激情| 午夜久久久在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲第一电影网av| xxx96com| 久久久久久久久中文| 精品福利观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品久久久久久精品电影 | 精品国产一区二区久久| 成年版毛片免费区| 99在线人妻在线中文字幕| 精品国产一区二区久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 麻豆av在线久日| 我的亚洲天堂| 日韩欧美国产一区二区入口| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产高清视频在线播放一区| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产野战对白在线观看| 国产成人影院久久av| 日韩大尺度精品在线看网址 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲五月婷婷丁香| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜日韩欧美国产| 欧美午夜高清在线| 无人区码免费观看不卡| 无限看片的www在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 天堂动漫精品| 在线永久观看黄色视频| 一进一出好大好爽视频| 国产黄a三级三级三级人| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美日韩一级在线毛片| 一个人免费在线观看的高清视频| 大型av网站在线播放| x7x7x7水蜜桃| 九色国产91popny在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 婷婷六月久久综合丁香| 久久香蕉激情| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品国产一区二区三区四区第35| 91国产中文字幕| 九色国产91popny在线| 成年版毛片免费区| 日本五十路高清| 久久中文看片网| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人影院久久av| 在线av久久热| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品亚洲一级av第二区| www.自偷自拍.com| 国产黄a三级三级三级人| 99精品久久久久人妻精品| 一本综合久久免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av电影不卡..在线观看| 97碰自拍视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 色播在线永久视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 中文亚洲av片在线观看爽| АⅤ资源中文在线天堂| 国产欧美日韩一区二区精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 黄色毛片三级朝国网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 精品人妻1区二区| 国产精品影院久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费在线观看日本一区| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜免费激情av| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费在线观看完整版高清| 黄色片一级片一级黄色片| 真人做人爱边吃奶动态| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲伊人色综图| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美日韩福利视频一区二区| 级片在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 天天添夜夜摸| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 视频区欧美日本亚洲| 波多野结衣一区麻豆| 精品日产1卡2卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲三区欧美一区| 黄色女人牲交| 大型av网站在线播放| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 久久久久亚洲av毛片大全| 长腿黑丝高跟| 免费观看人在逋| 制服诱惑二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 91精品三级在线观看| 久久九九热精品免费| 中文字幕久久专区| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩三级视频一区二区三区| 日韩高清综合在线| e午夜精品久久久久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 国产视频一区二区在线看| 久热这里只有精品99| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成a人片在线一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费在线观看日本一区| 久久香蕉精品热| 国产精品二区激情视频| 日韩有码中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品国产美女av久久久久小说| 久久精品人人爽人人爽视色| av福利片在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品免费视频内射| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美日韩乱码在线| 久久青草综合色| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲国产精品合色在线| 两个人免费观看高清视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 热99re8久久精品国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | АⅤ资源中文在线天堂| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产成年人精品一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| √禁漫天堂资源中文www| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲自拍偷在线| 久久久国产精品麻豆| 91国产中文字幕| 国产激情久久老熟女| 一级a爱视频在线免费观看| 久久精品国产清高在天天线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲第一av免费看| 国产成人精品久久二区二区91| 久久草成人影院| 成人国产综合亚洲| 亚洲人成77777在线视频| 高清在线国产一区| 美女大奶头视频| 国产成人av教育| 一区二区三区激情视频| 视频在线观看一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 欧美黑人精品巨大| 青草久久国产| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲三区欧美一区| 99热只有精品国产| 真人一进一出gif抽搐免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产亚洲av高清不卡| 一进一出好大好爽视频| 午夜精品在线福利| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99国产综合亚洲精品| 亚洲第一电影网av| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲熟妇熟女久久| 两性夫妻黄色片| 国产精品久久电影中文字幕| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美一区二区精品小视频在线| 成在线人永久免费视频| 少妇的丰满在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 极品人妻少妇av视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产成人影院久久av| 成年版毛片免费区| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 757午夜福利合集在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 性色av乱码一区二区三区2| 女人精品久久久久毛片| www日本在线高清视频| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| www.精华液| 黄色 视频免费看| 极品教师在线免费播放| 校园春色视频在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲国产看品久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美日韩精品网址| 久久人妻熟女aⅴ| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲全国av大片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品久久久久久成人av| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品久久久人人做人人爽| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费看十八禁软件| 黄色丝袜av网址大全| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人精品久久二区二区91| 日本在线视频免费播放| 精品福利观看| av欧美777| 欧美成人性av电影在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 黄色毛片三级朝国网站| 色哟哟哟哟哟哟| 深夜精品福利| 桃红色精品国产亚洲av| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 亚洲成国产人片在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 大陆偷拍与自拍| 中文字幕色久视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品人妻1区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 性少妇av在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩欧美在线二视频| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久国产a免费观看| 性欧美人与动物交配| 男女午夜视频在线观看| 中文字幕色久视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 制服丝袜大香蕉在线| e午夜精品久久久久久久| 天天一区二区日本电影三级 | 久久久国产成人精品二区| 看免费av毛片| 波多野结衣av一区二区av| 人成视频在线观看免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 波多野结衣av一区二区av| 欧美黄色淫秽网站| 一a级毛片在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 久久狼人影院| 级片在线观看| 亚洲,欧美精品.| 黑人欧美特级aaaaaa片| avwww免费| aaaaa片日本免费| 一区二区三区激情视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 在线免费观看的www视频| 免费在线观看黄色视频的| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 级片在线观看| 在线视频色国产色| 99在线视频只有这里精品首页| 成人永久免费在线观看视频| 日本 av在线| 亚洲成av人片免费观看| 黑人操中国人逼视频| 国产男靠女视频免费网站| 在线免费观看的www视频| 国产精华一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 国产欧美日韩一区二区三| 极品人妻少妇av视频| 乱人伦中国视频| 亚洲免费av在线视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 免费观看精品视频网站| 久久久久久大精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av视频在线观看入口| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产高清激情床上av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产私拍福利视频在线观看| 国内精品久久久久精免费| 午夜福利,免费看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品影院久久| 桃红色精品国产亚洲av| 咕卡用的链子| 国产又色又爽无遮挡免费看| 波多野结衣一区麻豆| 欧美性长视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品av久久久久免费| svipshipincom国产片| av天堂在线播放| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 黄色 视频免费看| 99久久国产精品久久久| 一级a爱片免费观看的视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲激情在线av| 一级毛片女人18水好多| 久久中文字幕人妻熟女| 中文字幕高清在线视频| 国产精品二区激情视频| 国产片内射在线| 精品久久久久久,| 国产色视频综合| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品二区激情视频| aaaaa片日本免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 极品教师在线免费播放| 窝窝影院91人妻| 少妇的丰满在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜福利欧美成人| 精品熟女少妇八av免费久了| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩欧美免费精品| 精品高清国产在线一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 悠悠久久av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲国产看品久久| 国产单亲对白刺激| 久久久久久人人人人人| 在线观看免费日韩欧美大片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 制服诱惑二区| 色在线成人网| 中文字幕最新亚洲高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 丝袜人妻中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲中文字幕日韩| 老鸭窝网址在线观看| 色播在线永久视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产成人精品无人区| 真人做人爱边吃奶动态| 深夜精品福利| 日本在线视频免费播放| 成人三级黄色视频| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品影院久久| 午夜成年电影在线免费观看| 天堂√8在线中文| 又黄又粗又硬又大视频| 一区二区三区精品91| 亚洲伊人色综图| 午夜久久久在线观看| 亚洲av成人av| 搞女人的毛片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人啪精品午夜网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产激情欧美一区二区| 久久香蕉国产精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 色综合站精品国产| 免费一级毛片在线播放高清视频 | av片东京热男人的天堂| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久亚洲真实| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久精品影院6| 伦理电影免费视频| 亚洲国产精品999在线| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久国产成人精品二区| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产激情欧美一区二区| 欧美在线一区亚洲| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 亚洲国产精品999在线| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av在线播放免费不卡| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲国产精品999在线| aaaaa片日本免费| 韩国精品一区二区三区| 国内精品久久久久久久电影| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 天堂动漫精品| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲精品一区av在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产高清videossex| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美国产日韩亚洲一区| 午夜福利一区二区在线看| 午夜久久久在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 99久久综合精品五月天人人| 乱人伦中国视频| 亚洲欧美激情综合另类| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美黄色淫秽网站| 成人国产综合亚洲| 亚洲美女黄片视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线观看午夜福利视频| 久久久久国内视频| netflix在线观看网站| 免费观看精品视频网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产伦人伦偷精品视频| 看免费av毛片| 深夜精品福利| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久狼人影院| 99久久综合精品五月天人人| 日本五十路高清| 两人在一起打扑克的视频| 精品电影一区二区在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 国产成人精品无人区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 嫩草影院精品99| 色播在线永久视频| 久久久久久大精品| 日韩欧美国产在线观看| av视频免费观看在线观看| 中出人妻视频一区二区| 免费看a级黄色片| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成+人综合+亚洲专区| videosex国产| 国产激情欧美一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| www.熟女人妻精品国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 妹子高潮喷水视频| 午夜免费激情av| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线观看午夜福利视频| 亚洲熟女毛片儿| 久久性视频一级片| 久久国产精品影院| 国产成人影院久久av| 国产精品99久久99久久久不卡| cao死你这个sao货| 欧美激情久久久久久爽电影 | 成人亚洲精品av一区二区| 无遮挡黄片免费观看| aaaaa片日本免费| 国产高清视频在线播放一区| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜视频精品福利|