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    TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá)的影響*

    2017-11-01 09:20:07莫選榮謝江文呂國菊柯于平羅心靜
    關(guān)鍵詞:滑膜活化克隆

    莫選榮, 謝江文, 呂國菊, 柯于平, 羅心靜△

    (1. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部, 浙江 臺州 318000; 2. 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院心內(nèi)科, 浙江 寧波 315000)

    TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá)的影響*

    莫選榮1, 謝江文2, 呂國菊2, 柯于平1, 羅心靜1△

    (1. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部, 浙江 臺州 318000; 2. 寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院心內(nèi)科, 浙江 寧波 315000)

    目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TAK1)基因沉默對腫瘤壞死因子a(TNF-a)誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞中促炎介質(zhì)白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)表達(dá)的影響,以探討TAK1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病中的作用。方法采取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將TAK1特異性的小干擾RNA(siRNA)和陰性對照RNA(scRNA)導(dǎo)入類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜成纖維細(xì)胞株MH7A細(xì)胞,然后分別用20 ng/ml TNF-a刺激后,檢測細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)和培養(yǎng)上清中IL-6和IL-8分泌情況以及p38、ERK、JNK、p65磷酸化的水平和抑制性蛋白IκBα的變化情況。結(jié)果siRNA-TAK1轉(zhuǎn)染72 h后滑膜細(xì)胞中TAK mRNA和蛋白表達(dá)的平均抑制率分別為75%和55%。siRNA-TAK1轉(zhuǎn)染下調(diào)TNF-a誘導(dǎo)狀態(tài)下IL-6和IL-8的表達(dá),并能抑制p38、JNK、p65磷酸化和增加IκBα水平。結(jié)論TAK1基因沉默能抑制TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6、IL-8表達(dá),可能與其抑制JNK和p38MAPK的活化及NF-κB的活化有關(guān)。

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;滑膜細(xì)胞;炎癥介質(zhì);TAK1

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性自身免疫性疾病。關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞在滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞中起重要作用,被認(rèn)為是治療RA的關(guān)鍵靶細(xì)胞[1]。研究表明,滑膜成纖維細(xì)胞被炎癥細(xì)胞因子IL-1和TNF-a激活后合成和分泌促炎介質(zhì)IL-6、IL-8和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP),

    使RA炎癥反應(yīng)持續(xù)存在并加重關(guān)節(jié)破壞。而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPKs)和核因子-κB(nuclear factor- kappa B,NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RA炎癥介質(zhì)過度表達(dá)中發(fā)揮重要作用[2-4]。

    轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activating kinase 1,TAK1)屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK)家族成員之一,能被多種促炎細(xì)胞介質(zhì)包括TNF-a、IL-1和LPS激活?;罨腡AK1通過激活MAPKK3/6(MKK3/6)導(dǎo)致MAPK途徑及NF-κB途徑活化而參與炎癥、免疫反應(yīng)等病理生理過程[5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn),在RA患者滑膜組織及促炎介質(zhì)誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞中TAK1表達(dá)顯著升高[6, 7],但其在RA病變中的作用及機(jī)制至今仍未闡明。

    本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)阻遏RA滑膜成纖維細(xì)胞中TAK1的表達(dá),觀察TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的IL-6、IL-8表達(dá)的影響,并探討其可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞株MH7A(日本)購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

    1.2 主要試劑

    兔抗TAK1多克隆抗體(美國Abcam公司);兔抗p-P38多克隆抗體、兔抗p-JNK多克隆抗體、兔抗p-ERK多克隆抗體、兔抗p-p65多克隆抗體、兔抗IκBα多克隆抗體(均購于美國Cell signaling公司);兔抗GAPDH單克隆抗兔(美國Santa cruz公司);羊抗兔Ig(美國Santa cruz公司);PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光液(美國Millipore公司);IL-6和IL-8 ELISA試劑盒(美國RD公司);power SYBR green PCR master mix (美國Applied Biosystems);first strand cDNA synthesis kit (美國Thermo scientific公司);Trizol reagent (美國Invitrogen公司);Lipofectamine RNAimax (美國Invitrogen公司);胎牛血清(美國Life Technologies公司);DMEM(美國Life Technologies公司);重組TNF-a蛋白(美國RD公司);TAK1小干擾RNA(siRNA)序列及陰性對照ScRNA序列由上海吉瑪公司合成;TAK1siRNA,正義鏈為5’GGACAUUGCUUCUA CAAAU3’,反義鏈為5’GAGUGAAUCUGGA CGUUUA3’.定量PCR引物TAK1、IL-6、IL-8和GAPDH引物由上海捷瑞生物公司合成(表1)。

    Tab. 1 Human primers used for quantitative PCR

    1.3 滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

    將MH7A滑膜成纖維細(xì)胞株用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時,用0.25%胰酶消化并接種于6孔板,實驗分為6組,正常對照組(ctrl)、TAK1 siRNA轉(zhuǎn)染組(siTAK1)、陰性siRNA轉(zhuǎn)染組(scRNA)、單純TNF-a組(TNF)、TAK1 siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-a組(siTAK1+TNF)、陰性siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-a組(sc+TNF)。每組細(xì)胞數(shù)接種3復(fù)孔,每孔細(xì)胞數(shù)為5×105。室溫下將20 nmol/L TAK1 siRNA或scRNA RNAiMax混合物分別轉(zhuǎn)染siTAK1組、siTAK1+TNF組和scRNA組、sc+TNF組滑膜細(xì)胞。于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育后72 h換液,ctrl組、siTAK1組和scRNA組換為含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液,TNF組、siTAK1+TNF組、sc+TNF組換為終濃度為20 ng/ml的TNF-a培養(yǎng)基。37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h,分別收集細(xì)胞或上清用于 IL-6和IL-8 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)分析。

    1.4 TAK1 siRNA轉(zhuǎn)染

    按照Lipofectamine RNAiMax試劑盒的操作說明進(jìn)行,將20 nmol/L TAK1 siRNA或ScRNA和RNAiMax混合物轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞,分別用定量PCR和Western blot檢測抑制效果。

    1.5熒光定量PCR法檢測IL-6和IL-8mRNA的表達(dá)

    滑膜細(xì)胞經(jīng)TNF-a處理4 h后,收集細(xì)胞,采用Trizon法提取總RNA。按cDNA合成試劑盒的操作說明,將RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)總體積為20 μl,包括10 μl power SYBR green PCR master mix, 100 ng cDNA and 0.2 mol/L 正義和反義引物。循環(huán)參數(shù):95℃ 5 min預(yù)變性,95℃變性1 min,60℃復(fù)性和延伸30 s,共40個循環(huán)。最后72℃延伸5 min。GAPDH作為內(nèi)參對照,定量采用比較Ct 法 (2-ΔΔCt)。

    1.6Westernblot法檢測磷酸化P38、JNK、ERK及p65、IκBα蛋白的表達(dá)

    滑膜細(xì)胞經(jīng)TNF-a處理15 min后,收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min,高速離心,收集蛋白上清。采用BCA法測定蛋白濃度,取20~30 μg蛋白上清與上樣緩沖液混合,100℃煮沸10 min,樣本經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后,采用濕轉(zhuǎn)法(380 mA,50~60 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜浸入含有5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫封閉2 h。然后加入羊抗兔TAK1抗體(1:1 000)、羊抗兔p-P38抗體(1:1 000)、兔抗p-JNK多克隆抗體(1:1 000)、兔抗p-ERK多克隆抗體(1:1 000)、兔抗p-p65多克隆抗體(1:1 000)、兔抗IκBα多克隆抗體(1:500)、羊抗兔GAPDH抗體(1:1 000)等,4℃孵育過夜,漂洗后,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig (1:5 000),反應(yīng)1 h。ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測膜上的抗原-抗體復(fù)合物, 置凝膠成像系統(tǒng)成像,灰度分析。GAPDH為內(nèi)參照物。

    1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

    TNF-a處理滑膜細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測上清中IL-6和IL-8,具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 TAK1基因沉默效果的評價

    熒光定量PCR結(jié)果顯示,與未處理的滑膜細(xì)胞相比,siRNA TAK1轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞48~72 h后TAK1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞TAK1 mRNA表達(dá)量與未處理細(xì)胞相比則無顯著差異。siRNA轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞72 h時TAK1 mRNA表達(dá)抑制效果最佳,平均抑制效率為75%(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示,siRNA TAK1轉(zhuǎn)染48~72 h后滑膜細(xì)胞TAK1蛋白表達(dá)量與正常對照相比顯著降低(P<0.05),而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞TAK1 蛋白表達(dá)量與正常細(xì)胞相比則無顯著差異。siRNA轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞72 h時TAK1蛋白平均抑制效率為55%(圖1B)。

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells,were left untreated (Ctrl) or transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for the indicated times. The expression of TAK1 mRNA and protein was assessed by real-time PCR (A) and by Western blot (B) respectively

    *P<0.05vsthe untreated cells (Ctrl)

    2.2 TAK1基因沉默對IL-6和IL-8表達(dá)的影響

    熒光定量PCR結(jié)果顯示,與未處理的正常細(xì)胞相比,基礎(chǔ)狀態(tài)時siRNA TAK1轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)呈下降趨勢,但并沒有顯著性差異。TNF-a刺激4 h時,IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)明顯升高。siRNA轉(zhuǎn)染能顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)與正常細(xì)胞相比則無顯著差異(圖2A、2C)。ELISA實驗顯示,TNF-a 刺激24 h時,滑膜細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8明顯升高。siRNA轉(zhuǎn)染顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞IL-6和IL-8蛋白的生成和分泌(P<0.05)。而scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8與正常細(xì)胞相比則無顯著差異(圖2B、2D)。

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells, were transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for 72 h, then incubated with TNF-α (20 ng/ml) for 4 h or 24 h. IL-6 (A, B) and IL-8 (C, D) expression was assessed by real-time PCR and ELISA)

    *P<0.05vsthe untreated cells (Ctrl);#P<0.05vsTNF-α group

    2.3 TAK1基因沉默對MAPK活化的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞相比,siRNA轉(zhuǎn)染能顯著抑制TNF-a誘導(dǎo)的P38和JNK的磷酸化,對TNF-a誘導(dǎo)的ERK的磷酸化無顯著影響(圖3)。

    2.4 TAK1基因沉默對NF-kB活化的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與scRNA轉(zhuǎn)染的滑膜細(xì)胞相比, siRNA TAK1轉(zhuǎn)染能顯著抑制基礎(chǔ)狀態(tài)或TNF-a刺激下滑膜細(xì)胞p65的磷酸化,并且能上調(diào) IκBa 的表達(dá)(圖4)。

    3 討論

    實驗關(guān)節(jié)炎動物和臨床患者關(guān)節(jié)炎的研究表明,滑膜成纖維細(xì)胞是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)關(guān)節(jié)滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞[8]?;こ衫w維細(xì)胞能被促炎細(xì)胞因子TNF-a、IL-1激活并合成和分泌促炎介質(zhì)。其中IL-6和IL-8是RA滑膜成纖維細(xì)胞合成和分泌的主要促炎介質(zhì)[9],在RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞中起到重要作用。IL-6被認(rèn)為是參與炎癥的重要細(xì)胞因子,它不僅能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和B淋巴細(xì)胞的分化,還能調(diào)節(jié)急性反應(yīng)期蛋白及其它炎癥介質(zhì)的生成,參與多種自身免疫性疾病,包括RA的病理過程。IL-8是重要的趨化因子,能趨化募集血液中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,在這些炎性細(xì)胞的滲出中起重要作用。RA患者的血漿和關(guān)節(jié)液中IL-6和IL-8水平顯著升高,并且與RA病變的活動性呈正相關(guān)[10]。RA患者或?qū)嶒炐躁P(guān)節(jié)炎大鼠實驗表明,封閉這些細(xì)胞因子及與其受體能顯著緩解病情進(jìn)展和減輕關(guān)節(jié)炎癥狀[11, 12]。我們和其他學(xué)者研究表明MAPKs和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了RA滑膜細(xì)胞中IL-6和IL-8生成的調(diào)節(jié)[3, 13,15]。

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells, were transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for 72 h, then incubated with TNF-α (20 ng/ml) for 15 min. The phosphorylation of P38,JNK and ERK was examined by Western blot

    *P<0.05

    Human fibroblast-like synoviocyte lines, MH7A cells, were transiently transfected with siRNA TAK1 (si-TAK1) or scrambled siRNA (scRNA) for 72 h, then incubated with TNF-α (20 ng/ml) for 15 min. The levels of p-p65 and nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells in hibitor, alpha(IκBa) was examined by Western blot

    *P<0.05

    TAK1作為MAPKKKs 家族成員之一,與免疫細(xì)胞胞質(zhì)中TAK1結(jié)合蛋白(TAK1-binding protein,TAB1/2)結(jié)合形成復(fù)合物,通過激活MAPKK3/6(MKK3/6)后,再進(jìn)一步激活P38、JNK和ERK等MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。近年來發(fā)現(xiàn)TAK1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織表達(dá)明顯升高,并且可能與實驗性關(guān)節(jié)炎病變進(jìn)展有關(guān)[6]。體外實驗表明,TAK1在IL-1誘導(dǎo)的RA滑膜細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,抑制其表達(dá)則顯著下調(diào)金屬蛋白酶3(MMP-3)和IL-6的表達(dá)[14]。我們應(yīng)用siRNA高效抑制滑膜細(xì)胞TAK1表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),TAK1基因沉默能抑制TNF-a誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的表達(dá),表明TNF-a通過TAK1誘導(dǎo)了IL-6和IL-8基因表達(dá)。我們研究提示TAK1可能參與滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8的過度表達(dá)而在RA發(fā)病中起重要作用。

    為了進(jìn)一步闡明TAK1調(diào)控炎癥因子的分子機(jī)制,我們檢測了TAK1對下游MAPK途徑信號分子P38,JNK和ERK活化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TAK1基因沉默滑膜細(xì)胞后TNF-a誘導(dǎo)的P38、JNK磷酸化水平明顯減少,而ERK磷酸化水平并沒有明顯改變,表明TAK1可能激活P38、JNK信號途徑調(diào)節(jié)TNF-a誘導(dǎo)的IL-6和IL-8表達(dá)。

    作為炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游重要的激酶,TAK1除了參與MAPK信號途徑的調(diào)節(jié)外,也參與NF-κB信號途徑的活化。NF-κB 是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子,一般是由p65和p50 亞單位組成的異源二聚體。在未激活狀態(tài)下, NF-κB 與抑制蛋白IκB 結(jié)合以無活性的形式存在于胞漿。當(dāng)細(xì)胞受炎癥介質(zhì)激活后解除 IκB 對NF-κB 的抑制作用,促進(jìn)NF-kB核易位,繼而激發(fā)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[16]。研究表明,TAK1與TAK1結(jié)合蛋白(TAB1)結(jié)合,激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)和IkB激酶(IKK),參與IL-1β激活的NF-κB活性的調(diào)節(jié)[5]。我們也觀察了TAK1基因沉默對TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞NF-κB途徑活化的影響。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞中TAK1表達(dá)阻遏后,NF-κB(p65)磷酸化水平降低,而抑制性蛋白IκBα的表達(dá)升高,這些結(jié)果表明TAK1基因沉默能抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB的活化。以上結(jié)果表明,TAK1參與滑膜細(xì)胞NF-κB途徑的活化調(diào)節(jié)而參與RA炎癥。

    總之,我們實驗結(jié)果表明TAK1參與TNF-a誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8表達(dá)的調(diào)節(jié),其機(jī)制可能與其激活下游信號分子JNK、P38及NF-κB活化有關(guān),TAK1在RA滑膜炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中可能起重要調(diào)節(jié)作用,并可能作為RA治療中的一種新的靶點。我們下一步動物實驗將進(jìn)一步驗證TAK1基因沉默對實驗性關(guān)節(jié)炎動物滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞的影響。

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    EffectsofTAKgenesilencingontheexpressionsofIL-6andIL-8inducedbyTNF-αinfibroblast-likesynoviocytes

    MO Xuan-rong1, XIE Jiang-wen2, LV Guo-ju2, KE Yu-ping1, LUO Xin-jing1△

    (1. Department of Basic Medical Sciences, School of Medicine of Taizhou University, Taizhou 318000;2. Department of Cardiology, Yingzhou District Second people's Hospital, Ningbo 315000, China)

    Objective: To investigate the effects of silencing transforming growth factor-β activating kinase 1 (TAK1)on the expressions of IL-6 and IL-8 induced by TNF-α in fibroblast-like synoviocytes, and to explore the role of TAK1 in rheumatoid arthritis (RA).MethodsThe synthesized TAK1 siRNA and scrambled siRNA (ScRNA) were transferred into cultured RA fibroblast-like synoviocyte line MH7A by lipofectamine. The expressions of the pro-inflammatory mediator IL-6 and IL-8 and the levels of phospho-P38(p-P38), phospho-C-Jun NH2-terminal kinase(p-JNK), phospho-extracellular signal-regulated kinase(p-ERK), phospho-p65(p-p65) and nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha(IκBa) were examined.ResultsSilencing of TAK was demonstrated in synoviocytes transfected by TAK siRNA. TAK1 silencing markedly attenuated the expression of IL-6 and IL-8 in the presence of TNF-α. TAK1 silencing inhibited the activation of p38 and JNK MAPK. TAK1 silencing also inhibited activation of nuclear factor-κB (NF-κB).ConclusionTAK1 silencing attenuated the expression of IL-6 and IL-8 in synoviocytes induced by TNF-αviainhibiting the activation of p38, JNK MAPK and NF-κB.

    rheumatoid arthritis; synoviocytes; inflammatory mediators; TAK1

    R392.12

    A

    1000-6834(2017)05-471-05

    10.12047/j.cjap.5494.2017.113

    國家自然科學(xué)基金面上項目(81373139);浙江省自然科學(xué)基金(LY16H100001);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(2015KYA206)

    2016-09-09

    2017-05-12

    Tel: 15068647955; E-mail: luoxjing@126.com

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