蛹蟲草優(yōu)良菌株的篩選*

于海洋，王延鋒，史 磊，王金賀，潘春磊，盛春鴿，劉姿彤，張 鵬，董雪梅

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041）

〈育種與馴化〉

蛹蟲草優(yōu)良菌株的篩選*

于海洋，王延鋒**，史 磊，王金賀，潘春磊，盛春鴿，劉姿彤，張 鵬，董雪梅

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041）

本試驗(yàn)通過對8株蛹蟲草菌株的菌絲生長速度、菌落平均直徑、液體發(fā)酵菌絲體干重、培養(yǎng)周期以及子實(shí)體形態(tài)、重量、粗多糖含量的對比研究，篩選出優(yōu)良的蛹蟲草菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，蛹蟲草菌株CC-8液體培養(yǎng)菌絲生物量明顯高于其他菌株，子實(shí)體出草整齊均勻，出草率高，形態(tài)好，產(chǎn)量高，顏色為橘黃，子實(shí)體粗多糖含量高于其他菌株，表明菌株CC-8具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可以作為栽培菌種進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

蛹蟲草；菌絲體；菌株篩選

蛹蟲草Cordyceps militaris(L.)Link.，又名北蟲草、蛹草等，隸屬真菌門（Fungi）蟲草科（Cordycipitaceae） 蟲草屬（Cordyceps），與野生冬蟲夏草同屬肉座菌目（Hypocreales）[1]。蛹蟲草在我國吉林省長白山以北地區(qū)以及遼寧、陜西、廣西、福建等地均有發(fā)現(xiàn)；國外主要分布在法國、德國、英國美國以及加拿大等地[2]。蛹蟲草對生長環(huán)境的要求較低，比較適合人工栽培[3]。蛹蟲草含有蟲草素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶、腺苷等多種活性物質(zhì)，能夠抑制腫瘤細(xì)胞[4-5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抑菌[8-9]、抗疲勞[10]、提高人體免疫[11-12]等。因此，通常把蛹蟲草作為冬蟲夏草的理想替代產(chǎn)品。本文通過對實(shí)驗(yàn)室保藏的8株蛹蟲草菌株進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出適合栽培的高產(chǎn)菌株，為生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

8株蛹蟲草菌株（Cordyceps militaris） 分別編號為 CC-1、CC-2、CC-3、CC-4、CC-5、CC-6、CC-7、CC-8。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 18 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蔗糖1%、蛋白胨2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，VB1微量，pH自然；固體栽培培養(yǎng)基：大米30 g，營養(yǎng)液30 mL（馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%，VB1微量）。1.1.3 試劑與儀器

葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂均購于天津市化學(xué)試劑供銷公司，其他試劑均為分析純。

GP-01光照培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；YXQ-LS-100A全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；YP1201N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；101A-S型數(shù)顯不銹鋼電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；HY-5回旋式振蕩器，大連富森有限公司。其他試驗(yàn)設(shè)備為一般常規(guī)儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將實(shí)驗(yàn)室4℃保存的8株蛹蟲草菌株活化后，分別轉(zhuǎn)接到90 mm裝有PDA培養(yǎng)基的平皿上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d備用。

1.2.2 菌絲生長速度測量和菌落形態(tài)觀察

用直徑8 mm打孔器取邊緣菌齡相同的菌塊，接種到90 mm PDA平皿中央，25℃恒溫培養(yǎng)15 d，采用十字交叉法測量菌落平均直徑，觀察菌株的菌落形態(tài)、菌絲濃密，測定菌絲生長速度。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 液體培養(yǎng)

將培養(yǎng)完全的種子液以10%的接種量接種到裝液量為100 mL的250 mL錐形瓶內(nèi)，25℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束后，用3層紗布過濾菌絲，蒸餾水清洗表面后，在60℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干至恒重，測定菌絲生物量。

1.2.4 出草復(fù)篩試驗(yàn)

將發(fā)酵完全的液體菌種，無菌操作接種到已滅菌完全的500 mL裝滿固體培養(yǎng)基的罐頭瓶中，每瓶接種5 mL液體菌種，置發(fā)菌室黑暗培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)菌、轉(zhuǎn)色、誘導(dǎo)子實(shí)體形成、子實(shí)體長出后采收，測定子實(shí)體形態(tài)、產(chǎn)量等[13]。

1.2.5 子實(shí)體活性多糖測定

將蛹蟲草子實(shí)體烘干至恒重，粉碎，取蛹蟲草粉末，用熱水浸提法提取蛹蟲草粗多糖，提取時(shí)間1 h，料液比1:10，提取3次，合并提取液，加3倍體積95%乙醇于4℃冰箱放置沉淀12 h后，利用4 000 r·min-1離心機(jī)，離心5 min，得到沉淀，經(jīng)丙醇、無水乙醚洗滌后冷凍干燥，采用稱質(zhì)量法測定多糖得率[14]。多糖得率（P） 公式為：

式中：m1表示多糖干品的質(zhì)量；m2表示子實(shí)體樣品的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果

8株蛹蟲草菌株菌絲生長速度見圖1和表1。

由圖1、表1可知，不同菌株的日均生長速度和菌落形態(tài)明顯不同，日均生長速度范圍從2.2 mm·d-1～3.9 mm·d-1；生長初期，菌絲處于適應(yīng)期生長十分緩慢，后期長勢明顯加快。其中CC-1、CC-8菌株的菌絲生長一直緩慢，菌落形態(tài)分別為致密、白色和稀疏、淺黃；CC-2、CC-3、CC-4、CC-5、CC-7菌株日均生長速度相差不多；CC-6菌株后期菌絲生長較快，說明菌絲生長能力較強(qiáng)，菌落形態(tài)為致密、絨毛狀、白色。

2.2 菌絲生物量測定

8株蛹蟲草菌株菌絲生物量測定結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，8株蛹蟲草菌株液體培養(yǎng)菌絲生物量范圍0.27 g～0.87 g，差異較為明顯。其中CC-3、CC-6菌株的菌絲生物量較小，說明液體培養(yǎng)菌絲生長能力較弱；CC-1、CC-2、CC-8菌株的菌絲生物量較大，其中CC-8菌株的菌絲生物量最大，CC-7次之，說明CC-7、CC-8菌株菌絲液體培養(yǎng)的生長能力較強(qiáng)。

圖2 蛹蟲草菌絲生物量Fig.2 Mycelium biomass of Cordyceps militaris

2.3 栽培試驗(yàn)

蛹蟲草菌株的復(fù)篩栽培試驗(yàn)結(jié)果見圖3和表2。

由圖3、表2可以看出，CC-3菌株未長出子實(shí)體也未轉(zhuǎn)色；CC-6菌株也幾乎未長出子實(shí)體；CC-1、CC-2菌株長出部分子實(shí)體但子實(shí)體形態(tài)畸形且CC-2菌株第44天就不再繼續(xù)生長；CC-4、CC-5、CC-7、CC-8菌株產(chǎn)量均較高，但CC-5菌株子實(shí)體形態(tài)畸形，參差不齊；CC-7菌株雖然產(chǎn)量最高，子實(shí)體形態(tài)整齊，但大多粗短形態(tài)不佳；CC-8菌株產(chǎn)量略低于CC-7菌株但高于CC-4菌株，子實(shí)體形態(tài)淺黃、細(xì)長且整齊，是優(yōu)良菌株。

圖3 不同菌株人工栽培的子實(shí)體形態(tài)Fig.3 Fruitbody morphology of different strains in artificial cultivation

2.4 粗多糖含量

8株蛹蟲草菌株的復(fù)篩試驗(yàn)粗多糖含量見表3。

由表3可知，8株菌株粗多糖含量差異明顯，其中CC-3、CC-6菌株未形成子實(shí)體，作為淘汰菌株；CC-1、CC-2菌株粗多糖含量較低；CC-4、CC-5、CC-7、CC-8菌株粗多糖含量均較高，其中CC-8菌株粗多糖含量最高，并且子實(shí)體形態(tài)細(xì)長且整齊，說明CC-8菌株最適合作為栽培菌株進(jìn)行生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過保藏的8株蛹蟲草菌種進(jìn)行菌絲體生長狀態(tài)的測定、液體培養(yǎng)生物量積累的測定、出草試驗(yàn)、子實(shí)體活性多糖的測定等，確定CC-8菌株的液體發(fā)酵生物量最大，液體發(fā)酵菌絲體生長能力較強(qiáng)，菌株產(chǎn)量較高，子實(shí)體形態(tài)淺黃、細(xì)長且整齊，子實(shí)體所含蟲草多糖量最高。因此，確定CC-8菌株為優(yōu)良菌株。

表2 栽培試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of cultivation test

表3 粗多糖得率Tab.3 Polysaccharides yields

CC-1、CC-2菌株長出部分子實(shí)體，但子實(shí)體形態(tài)畸形且CC-2第44天就不再繼續(xù)生長；CC-5菌株子實(shí)體形態(tài)參差不齊，有可能菌株在出草階段培養(yǎng)基營養(yǎng)供給不充足，影響子實(shí)體生長。因此應(yīng)該針對不同地域來源菌株篩選出不同培養(yǎng)基。CC-3、CC-6菌株菌絲生長較快，菌落形態(tài)致密，白色絨毛，說明CC-3、CC-6菌株菌絲平皿生長能力較強(qiáng)，但幾乎未長出子實(shí)體，未能進(jìn)行子實(shí)體多糖提取試驗(yàn)，可能是在保藏過程中菌種發(fā)生退化，菌種退化問題是蛹蟲草培養(yǎng)過程中面臨的主要問題。因此應(yīng)及時(shí)進(jìn)行菌種復(fù)壯或研究如何選育出高產(chǎn)、穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。

蟲草多糖可作為篩選蛹蟲草優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)之一，其提取方法很多。本試驗(yàn)通過熱水浸提的方法對蛹蟲草多糖進(jìn)行提取，其中單糖、蛋白質(zhì)、色素及鞣質(zhì)等雜質(zhì)也一并被提取出來，因此如何除去蟲草多糖中的雜質(zhì)成分獲得精制多糖還有待進(jìn)一步研究。

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Screening on Fine Cordyceps militaris Strains

YU Hai-yang,WANG Yan-feng,SHI Lei,WANG Jin-he,PAN Chun-lei,SHENG Chun-ge,LIU Zi-tong,ZHANG Peng,DONG Xue-mei
(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang 157041,China)

In this experiment,mycelium growth rate,colony average diameter,mycelium dry weight of liquid fermentation,cultivate cycle,fruiting body morphology,weight and crude polysaccharide content of eight Cordyceps militaris strains were studied and compared,then a fine strain was screened.The test results showed that strain CC-8 which had a higher mycelium biomass and polysaccharides was the fine strain,it had the characteristic of orange and regular fruiting bodies,high fruiting incidence and yield,which was better than others.Purporting strain CC-8 was a fine species with high economic value,and CC-8 strain can be as a cultivated strain for industrial production.

Cordyceps militaris;mycelium;strain screening

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0017-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.004

中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目（ZY16B08）；國家級星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2015GA670002）。

于海洋（1986-），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事食（藥）用菌遺傳育種。E-mail:haiyang234@126.com

**通信作者：王延鋒（1973-），男，博士，研究員，從事食（藥）用菌遺傳育種、栽培與菌渣綜合利用研究。E-mail:mdjnks@126.com收稿日期：2017-07-16