地膚子總黃酮含量測定及其抗氧化活性

李培源　盧汝梅　蘇煒　滕明敏　郭娜娜　吳采穎

摘要：研究地膚子不同溶劑提取物的總黃酮含量及其抗氧化活性。用冷浸法得到地膚子乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物。測定了三種提取物的總黃酮含量，并通過測定其對(duì)DPPH自由基的清除能力和還原能力來研究其抗氧化能力。地膚子不同溶劑提取物均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化性能，其抗氧化能力隨提取物濃度增大而增強(qiáng)。地膚子提取物具有作為天然抗氧化劑的潛力。

關(guān)鍵詞：地膚子；DPPH；還原能力；抗氧化；總黃酮含量

地膚（Kochia scoparia）是藜科一年生草本植物，高50-100 am。地膚子為地膚的果實(shí)，扁球狀五角星形，直徑1～3 mm，具有清熱利濕、祛風(fēng)止癢等功效，主治小便澀痛、陰癢帶下、風(fēng)疹、濕疹、皮膚瘙癢等疾病。地膚子在民間使用廣泛，但其抗氧化方面的研究鮮見報(bào)道。抗氧劑可以清除人體內(nèi)過量的自由基，預(yù)防動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肌肉萎縮和老年癡呆等多種疾病。目前，使用較多的合成抗氧化劑如2.6-二叔丁基4-甲基苯酚等具有較多副作用，因此近年來科研工作者致力于尋找來源于植物的天然抗氧化劑。本試驗(yàn)通過測定地膚子3種溶劑提取物（乙醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物）對(duì)DPPH自由基的清除能力和還原能力來對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行研究，為地膚子作為一種天然高效抗氧化物的推廣利用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

地膚子來源于廣西玉林。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于百靈威試劑公司（北京）。所有試劑均為分析純。UV1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析電子科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1地膚子不同溶劑提取物制備 稱取20 g地膚子粉末，加入200 mL乙醇（95%），冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到地膚子乙醇提取物（EE）0.8 g，得率為4.0%。采用相同方法，用丙酮及乙酸乙酯提取，得到丙酮提取物（AE）0.6 g和乙酸乙酯提取物（EAE）0.8 g，得率分別為3.0%和4.0%。

1.2.2地膚子總黃酮含量的測定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確吸取蘆丁對(duì)照品溶液（1 mg/mL）于10 mL量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，靜置6 min，加入5%硝酸鋁0.4 mL，靜置6 min。再加入5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，在510nm處測定其吸光度。以吸光度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

2）地膚子提取物總黃酮含量測定。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液，同上操作測定其吸光度，多次測量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量，總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量（mg）表示，并計(jì)算提取得率。

1.2.3地膚子提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力測定取不同濃度地膚子提取物溶液（0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0 mg/mL）加入8 mL DPPH（0.004%）溶液中。在最大波長處（517 nm）測定其吸光度，直到平衡為止。清除率計(jì)算公式為s=（1-A樣品）/A空白×100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

1.2.4還原能力測定 取上述不同濃度地膚子提取物溶液0.2 mL，加入2.5 mL PBS溶液（pH 7.4），2.5 mL KFe（CN）4（1%）。于50℃恒溫20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%），離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL FeCl3（1%），混勻。在700 nm處測定其吸光度，以蒸餾水為參比。

2.結(jié)果與分析

2.1地膚子提取物總黃酮含量

以吸光度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=9.677 8x+0.016 7（R=0.9992）。根據(jù)線性方程得出地膚子乙醇提取物（EE）、丙酮取物（AE）和乙酸乙酯提取物（EAE）的總黃酮含量測定結(jié)果。結(jié)果表明，3種提取物的總黃酮含量在29.5～43.5 mg/g之間，均具有較高的黃酮含量，具有作為自由基清除劑應(yīng)用的潛力。

2.2地膚子提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

地膚子3種溶劑提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果如圖1所示。3種提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨其濃度的升高而增強(qiáng)。對(duì)于AE，濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí)，清除率分別為27.8%和37.7%，濃度增加到1.2、1.5 mg/mL時(shí)，清除率增大為47.9%和57.6%。當(dāng)AE濃度增加到1.8、2.0 mg/mL時(shí)，清除率增大到64.8%和70.2%。對(duì)于EAE，當(dāng)濃度從0.5 mg/mL增加到2.0 mg/mL，清除率從23.9%增加到72.4%。

當(dāng)提取物濃度較低時(shí)（0.5和0.8 mg/mL），AE和EE表現(xiàn)出相近的DPPH自由基清除能力。而在較高提取物濃度（1.8和2.0 mg/mL）時(shí)，EE表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力，在1.8 mg/mL時(shí)清除率為73.6%，在最高濃度2.0 mg_/mL時(shí)清除率為85.8%。結(jié)果表明，地膚子的3種提取物對(duì)于DPPH自由基均具有很強(qiáng)的清除能力。

2.3不同溶劑提取物EC50值

EG50代表抗氧化劑對(duì)自由基達(dá)到半抑制時(shí)的質(zhì)量濃度。EG50的數(shù)值越大，則表明抗氧化劑對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。地膚子3種提取物EE、AE和EAE對(duì)DPPH自由基的EC值分別為1.13、1.28、1.15 mg/mL。因此，3種提取物的EGo值大小順序?yàn)锳E、EAE、EE。即，地膚子不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力順序?yàn)镋E>EAE>AE。

2.4地膚子提取物的還原能力

地膚子不同溶劑提取物的還原能力如圖2所示?？寡趸瘎┩ㄟ^自身的還原作用給出電子從而達(dá)到清除自由基的效果，還原能力越強(qiáng)，則抗氧化性越強(qiáng)。測定結(jié)果以吸光度表示，吸光度越高表示還原能力越強(qiáng)。地膚子3種提取物的還原能力均與提取物濃度呈正相關(guān)，即提取物濃度越高，其還原能力越強(qiáng)。對(duì)于AE，濃度為0.5和0.8mg/mL時(shí)吸光度分別為0.29和0.33，濃度為1.0和1.2mg/mL時(shí)吸光度分別為0.46和0.53，當(dāng)濃度增大為1.8和2.0mg/mL時(shí)，吸光度分別為0.73和0.89。對(duì)于EE，按濃度由低至高其吸光度分別為0.21、0.41、0.51、0.61、0.63、0.80和0.86，其還原能力隨濃度增大而增強(qiáng)。在較高濃度時(shí)（2.0 mg/mL），3種提取物的還原能力接近，AE、EE和EAE的吸光度分別為0.89、0.86和0.88。

3.小結(jié)

本試驗(yàn)測定了常用中藥地膚子不同溶劑提取物的總黃酮含量，并通過DPPH自由基體系和還原能力來研究其抗氧化性能。結(jié)果表明，地膚子不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基均顯現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，濃度為2.0 mg/mL時(shí)EE的清除率為85.8%。EC值分析結(jié)果表明，不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力順序?yàn)镋E>EAE>AE。不同地膚子提取物均具有很強(qiáng)的還原能力，且還原能力隨提取物濃度增大而增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，地膚子不同溶劑提取物，特別是EAE，具有優(yōu)良的清除自由基能力和抗氧化能力，有望作為天然抗氧化劑在工業(yè)上應(yīng)用。