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    樺褐孔菌醇對人胃癌BGC-823細(xì)胞周期的影響及其機制

    2013-09-13 01:49:00鐘秀宏孫艷美趙麗微楊淑艷關(guān)曉輝
    中國老年學(xué)雜志 2013年15期
    關(guān)鍵詞:橘紅色染色質(zhì)細(xì)胞周期

    崔 濤 鐘秀宏 孫艷美 趙麗微 楊淑艷 關(guān)曉輝

    (北華大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,吉林 吉林 132011)

    樺褐孔菌提取物樺褐孔菌醇(Inotodiol)對多種人類腫瘤均有較強的抗腫瘤作用〔1,2〕。本研究前期通過MTT細(xì)胞活性分析Inotodiol對人胃癌BGC-823細(xì)胞有較顯著的抑制作用,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測可呈劑量依賴性阻滯細(xì)胞于 S期〔3,4〕?;蛲蛔儭⑹Щ钜约斑^度表達(dá)或表達(dá)降低等可引起腫瘤細(xì)胞周期變化,而藥物如果作用過的腫瘤細(xì)胞在一定時間內(nèi)無法克服細(xì)胞周期阻滯時就會發(fā)生凋亡。因此,本實驗通過形態(tài)學(xué)觀察Inotodiol對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響,然后通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測CyclinA、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和p21細(xì)胞周期蛋白表達(dá),以進一步探索Inotodiol對BGC-823細(xì)胞產(chǎn)生S期阻滯的可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株BGC-823購自中科院上海細(xì)胞所。Inotodiol由河南大學(xué)藥學(xué)院趙芬琴博士提取并鑒定。胎牛血清(杭州四季青公司),RPMI1640和0.25%胰酶(Gibco,美國);CyclinA、p21 抗體、PCNA(Santa Cruz,美國)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 胃癌BGC-823細(xì)胞株生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,另加青霉素100 U/ml、鏈霉素100 g/ml,置于37℃、5%CO2及飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待胃癌BGC-823細(xì)胞生長旺盛,取對數(shù)生長期細(xì)胞接種細(xì)胞于6孔板或25 cm2培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞長到80% ~90%融合度時,吸盡培養(yǎng)液,實驗組加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基配制的不同濃度(20、40、80 g/ml)Inotodiol,對照組加入等量不含Inotodiol的無血清 RPMI1640培養(yǎng)基,共同培養(yǎng)48 h,備用。

    1.3 光學(xué)顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞爬片,經(jīng)Inotodiol 80 g/ml作用48 h后,HE染色常規(guī)檢測。

    1.4 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞爬片,經(jīng)Inotodiol 80 g/ml作用48 h后,加吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合液滴于蓋玻片上(避光),在Olympus熒光顯微鏡下觀察,活細(xì)胞(VN)核染色質(zhì)綠色,呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)。早期凋亡細(xì)胞(VA)核染色質(zhì)綠色,呈固縮狀。晚期凋亡細(xì)胞(NVA)核染色質(zhì)橘紅色,呈固縮狀或破裂狀。壞死細(xì)胞(NVN)核染色質(zhì)橘紅色,呈正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)。隨機選擇3個不同高倍視野(×400),細(xì)胞凋亡率(%)=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。

    1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測 CyclinA、p21、PCNA蛋白的表達(dá) 終濃度為80 g/ml的Inotodiol作用于胃癌BGC-823細(xì)胞48 h后,在4℃條件下用冷丙酮固定10 min,按試劑說明進行SP法免疫細(xì)胞化學(xué)染色。判定標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈清晰棕黃色為陽性細(xì)胞。隨機選取10個高倍視野,分別計數(shù)陽性細(xì)胞百分比。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1 Inotodiol誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化 HE染色光鏡觀察,對照組腫瘤細(xì)胞生長旺盛,呈不規(guī)則形,細(xì)胞核染色均勻,核仁清晰可見,核分裂像多見。實驗組腫瘤細(xì)胞體積縮小,呈圓形或不規(guī)則形,胞質(zhì)濃縮,核染色質(zhì)濃縮,有的細(xì)胞膜起泡形成凋亡小體(圖1)。AO/EB熒光染色熒光顯微鏡下觀察,對照組腫瘤細(xì)胞大小形狀較單一,核染色質(zhì)呈綠色或黃綠色均勻熒光,胞質(zhì)呈橘紅色熒光。實驗組BGC-823胃癌細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小呈圓形,細(xì)胞周圍可見亮綠色或黃綠色熒光的圓形凋亡小體,胞核染色質(zhì)呈綠色或橘紅色,胞質(zhì)內(nèi)的橘紅色或橘黃色熒光減弱或消失。壞死細(xì)胞核染色質(zhì)呈橘紅色,胞質(zhì)膨脹或破裂(圖2)。80 g/ml樺褐孔菌醇作用BGC-823胃癌細(xì)胞48 h,凋亡率為25%(見表1)。

    2.2 Inotodiol對BGC-823細(xì)胞 CyclinA、PCNA、p21表達(dá)的影響 80 g/ml Inotodiol作用于BGC-823細(xì)胞48 h后,與對照組相比,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinA、PCNA蛋白的表達(dá)減少和p21蛋白表達(dá)增加(P<0.01,見圖3,表2)。

    表1 兩組BGC-823細(xì)胞凋亡情況比較(n)

    圖1 HE染色光學(xué)顯微鏡觀察BGC-823細(xì)胞凋亡(×400)

    表2 兩組BGC-823細(xì)胞CyclinA、PCNA和p21表達(dá)比較(n=10,±s)

    表2 兩組BGC-823細(xì)胞CyclinA、PCNA和p21表達(dá)比較(n=10,±s)

    組別CyclinA PCNA p21對照組56.7±2.3 65.4.±2.7 19.2.±4.4實驗組 26.9±2.91) 26.9±3.21) 45.2±4.71)

    圖2 AO/EB熒光染色熒光顯微鏡觀察BGC-823細(xì)胞凋亡(×400)

    圖3 兩組胃癌BGC-823細(xì)胞CyclinA、PCNA、p21表達(dá)(×400)

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),Inotodiol作用BGC-823細(xì)胞48 h后,除了對細(xì)胞增殖的影響外,在進行HE染色及AO/EB熒光染色中形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),Inotodiol有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

    腫瘤是一種周期性疾病,腫瘤細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡都與細(xì)胞周期受阻密切相關(guān),三者之間存在復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)〔5〕。Yuki等〔6〕的研究表明,樺褐孔菌提取物可誘導(dǎo) IMR90細(xì)胞阻滯于S期,并可引起細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡的變化,與κB受抑制有關(guān);Youn等〔7〕報道,樺褐孔菌提取物使肝癌HEPG2細(xì)胞阻滯于 G0/G1期,并通過抑制 CyclinD1,CyclinD2,CyclinE,CDK2,CDK6抑制腫瘤細(xì)胞生長。

    CyclinA是S期細(xì)胞周期蛋白,屬于正向細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,關(guān)鍵作用是促進DNA合成。PCNA是一種酸性核蛋白,它是DNA聚合酶δ的一個附屬蛋白,它能在雙鏈DNA周圍形成一個滑動夾板,從而與DNA聚合酶δ相互作用,并使之持續(xù)合成DNA,PCNA在細(xì)胞周期的S期和G2期數(shù)量增高,因此,PCNA是DNA合成中的一個重要調(diào)節(jié)因子。而p21是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子,能抑制PCNA的活性直接抑制DNA的合成〔8,9〕,高表達(dá)時可阻斷正常細(xì)胞周期進程。Inotodiol可能通過減少CyclinA、PCNA細(xì)胞周期蛋白的生成和上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p21的表達(dá),影響細(xì)胞周期,致使產(chǎn)生S期阻滯,進而實現(xiàn)其對人胃癌BGC-823細(xì)胞的抗癌效應(yīng)。

    1 Zhong XH,Wang LB,Sun DZ,et al.Effects of Inotodiol extracts from inonotus obliquus proliferation cycle and apoptotic gene of human lung ade-nocarcinoma cell line A549〔J〕.Chin J Integr,2011;17(3):218-23.

    2 Zhong XH,Ren K,Lv SJ,et al.Progress of research on Inonotus obliquus〔J〕.Chin J Integr Med,2009;15:156-60.

    3 崔 濤,鐘秀宏,楊淑艷,等.樺褐孔菌的不同提取物對胃癌BGC-823細(xì)胞株的生長抑制作用的體外觀察〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2012;20(32):4442-3.

    4 鐘秀宏,楊淑艷,孫東植,等.樺褐孔菌提取物誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的研究〔J〕.中國藥房,2007;18(34):2661-3.

    5 Subbareddy M,Sudharsana RA,Soumya P,et al.Cell survival,cell death and cell cycle pathways are interconnected:implications for cancer therapy〔J〕.Drug Resistance Updates,2007;10(1-2):13-29.

    6 Yuki Nakajima,Hiroshi Nishida,Seiichi Matsugo,et al.Cancer cell cytotoxicity of extracts and small phenolic compounds from chaga Inonotus obliquus(persoon)Pilat〔J〕.J Med Food,2009;12(3):501-7.

    7 Youn MJ,Kim JK,Park SY,et al.Chaga mushroom(Inonotus obliquus)induces G0/G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells〔J〕.World J Gastroenterol,2008;14(4):511-7.

    8 Levin DS,Bai W,Yao N,et al.An interaction between DNA ligaseⅠ and proliferating cell nuclear antigen:implications for okazaki fragment synthesis and joining〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(24):12863.

    9 Pan ZQ,Reardon JT,Li L,et al.Inhibition of nucleotide excision repair by the cyclin-dependent kinase inhibitor p21〔J〕.J Biol Chem,1995;270(37):220-8.

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