α-SMA與TGF-β1在大鼠肝纖維化中的表達及相互關系

原冬偉，劉秋瑾，劉宏睿，王曉雅，張佳韌，范文祿

α-SMA與TGF-β1在大鼠肝纖維化中的表達及相互關系

原冬偉，劉秋瑾，劉宏睿，王曉雅，張佳韌，范文祿

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319）

為明確α-SMA和TGF-β1在肝臟纖維化過程中的作用和相互關系，研究首先利用CCl4腹腔注射的方法建立肝臟纖維化大鼠模型，通過組織學、免疫組織化學及蛋白組學方法檢測肝臟纖維化過程中病理組織結構變化、α-SMA和TGF-β1的表達情況。結果顯示肝臟纖維化模型造模成功，肝臟組織呈現(xiàn)明顯纖維化病變特征，α-SMA和TGF-β1的表達呈陽性，且與肝臟纖維化程度呈正相關。α-SMA和TGF-β1是肝臟纖維化過程中的重要細胞因子，能夠促進肝臟纖維化的形成，并可能協(xié)同參與。

肝臟纖維化；CCl4；α-SMA；TGF-β1；大鼠

肝臟纖維化是以肝臟損傷后細胞外基質沉淀為特征，是肝實質細胞被進展性增生細胞外基質所替代的過程，最終導致肝臟小葉結構改變及血管紊亂[1,2]。肝臟纖維化發(fā)生過程中沉積細胞外基質可來源于不同類型的細胞，肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）是肝臟纖維化過程中最關鍵的效應細胞[3]。HSC在多種細胞因子的作用下被激活，進而轉化為具有促纖維化、增生、趨化等功能的肌成纖維樣細胞[4]。細胞因子的作用可以影響肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，特別是與HSC活化相關的α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）和促纖維化效應轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）。α-SMA是HSC活化的標志，HSC活化產生的TGF-β1是最重要的致纖維化因子[5]。通檢測大鼠肝臟纖維化模型中α-SMA和TGF-β1的表達情況，闡明二者在纖維化過程中的作用和相互關系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設備

無水乙醇、二甲苯、40%甲醛溶液、CCl4均購自哈爾濱賽特生物技術有限公司。愛德士生化分析儀專用試劑片、HE染色試劑盒均購自哈爾濱佰杰斯生物科技公司。濃縮型SABC-DyLight 488（大鼠IgG）試劑盒、DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司。TGF-β1、α-SMA抗體購自Sigma公司。橄欖油為市售。梅特勒電子天平（ME1002TE），徠卡自動載玻片染色機（Leica ST5010）購自黑龍江省海金蘭科技發(fā)展有限公司；生物組織脫水機（KD-TS3A），生物組織冷凍包埋機（KD-BM、BL），轉輪式石蠟切片機（KD-2258），生物組織攤烤片機（KD-T），購自浙江金華科迪儀器設備有限公司；愛德士生化分析儀（IDXX VetTest8008），購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；麥克奧迪光學顯微鏡（BA310）及成像系統(tǒng)，購自北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司。

1.2 肝纖維化模型制備

清潔級雄性SD大鼠20只，體重200～220 g，按體質量隨機分成2組：對照組和模型組。模型組大鼠腹腔注射 40%CCl4橄欖油溶液 3 mL·kg-1，3 次·wk-1[6]，造模8周，基礎飼料飼喂，礦物水飲水。對照組同模型組等劑量腹腔注射生理鹽水，基礎飼料飼喂，自來水飲水。實驗期間觀察各組大鼠一般情況，包括精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度、食量、存活率等。在造模第4、8周分別取各組大鼠各5只，乙醚麻醉后打開腹腔下腔靜脈采全血分離血清，同時觀察肝臟外觀變化并摘取部分肝臟組織置于10%甲醛溶液固定，部分肝臟組織-70℃凍存。實驗過程中死亡大鼠同樣進行剖檢取材。

1.3 肝臟功能指標檢測

全血分離血清后送檢黑龍江八一農墾大學動物醫(yī)院化驗室，檢測指標包括：反映肝臟細胞蛋白合成代謝的總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）；反映肝臟細胞受損的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草酸轉氨酶（AST）、伽馬谷氨酰胺轉肽酶（GGT）。

1.4 病理組織學觀察及蛋白免疫印跡檢測

按照常規(guī)方法制備高質量肝臟組織切片[7]。蘇木素-伊紅（H.E.）和AZAN染色顯微鏡觀察肝小葉結構變化及纖維化程度判定。SABC免疫組織化學法和Western-blot法檢測肝臟組織中α-SMA和TGF-β1的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，試驗結果數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 實驗結果

2.1 大體觀察

對照組大鼠毛發(fā)光澤，活潑好動，食欲正常，體重增加，對外界反應敏感。模型組大鼠毛發(fā)疏松無光澤，精神不振，不愿走動，食欲差，體重增長緩慢。各組大鼠體重變化情況見表1。實驗期間模型組大鼠在第7周、第8周各死亡1只。

表1 實驗組大鼠體重變化情況（g）Table 1 Changes of body weight of rats in experimental group（g）

2.2 肝功指標監(jiān)測

模型組大鼠血清中ALT、AST指標在第4周、第8周與對照組比較明顯升高，呈極顯著性差異（P＜0.01）。模型組大鼠血清中GGT指標也明顯升高，與對照組比較呈顯著性差異（P＜0.05）。模型組大鼠血清中ALB、TP與對照組比較指標降低，與同期對照組比較呈顯著性差異（P＜0.05）。數(shù)據(jù)詳見表2，表3，所有數(shù)據(jù)表明模型組大鼠肝臟明顯受損。

表2 實驗組大鼠4周血清肝功指標Table 2 Liver function of experimental rats at 4 weeks

表3 實驗組大鼠8周血清肝功指標Table 3 Liver function of experimental rats at 8 weeks

2.3 病理組織學觀察及蛋白免疫印跡檢測

對照組大鼠肝臟組織未見明顯結構改變，模型組大鼠肝臟的病理學改變大致分為：炎癥反應、間質細胞增生及彌漫性纖維化。H.E.染色結果顯示，對照組肝臟組織肝臟細胞大小正常，小葉結構清晰，細胞核圓，胞質豐富。模型組4周時肝臟組織肝細胞結構基本正常，肝細胞脂肪變性，匯管區(qū)結構清晰，小葉間纖維結締輕度增生（圖1）；8周時肝臟細胞脂肪變性變輕，可見肝細胞壞死，小葉內可見成纖維樣細胞，匯管區(qū)和小葉間纖維結締組織增生，少量炎性細胞浸潤（圖1）。AZAN染色結果顯示，對照組肝臟組織無膠原纖維異常沉積現(xiàn)象。模型組4周和8周時在小葉周邊、門脈區(qū)、小葉內均可見膠原纖維沉積現(xiàn)象（圖1）。免疫組織化學染色結果顯示，α-SMA在大鼠肝臟中表達在小葉周、門脈區(qū)及增生的纖維組織，且隨造模時間延長表達量逐漸增加；TGF-β1在大鼠肝臟中表達在肝竇狀隙邊緣肝枯否細胞和肝星狀細胞的胞漿中，表達水平也隨時間延長逐漸增加（圖2）。蛋白組學結果與免疫組化結果一致，α-SMA和TGF-β1蛋白表達量在模型組大鼠肝臟組織中逐漸升高，且二者也呈現(xiàn)正相關情況（圖3）。

圖1 大鼠肝臟病理組織學觀察Fig.1 Histopathological observation of rat liver

圖2 α-SMA和TGF-β1在大鼠肝臟組織中的表達Fig.2 Expression of α-SMA and TGF- β1 in rat liver tissue

圖3 α-SMA和TGF-β1蛋白在大鼠肝臟組織中的表達Fig.3 Expression ofα-SMA and TGF- β1 protein in rat liver tissue in vivo

3 討論

肝纖維化是許多肝臟慢性疾病共有的病理改變，是各種原因引起肝臟損傷后的疤痕修復反應，其表現(xiàn)為肝功能下降，肝內廣泛纖維組織增生和細胞外基質的重塑[8，9]。目前肝纖維化造模方法很多而且發(fā)展成熟，主要被應用在研究其發(fā)病機制和篩選有效治療藥物等方面。CCl4經腹腔注射法制備大鼠肝纖維化動物模型是一種經典的動物模型制備方法[6]，以其制模方便、時間短、成模率高的特點被廣泛應用在臨床和實驗研究上。研究參考已有文獻報道造模方法，以低劑量CCl4腹腔注射，經門靜脈系統(tǒng)吸收入血引起肝纖維化形成。實驗結果顯示肝纖維化動物模型造模成功，大鼠肝臟發(fā)生肝細胞的變性、壞死，小葉間和門脈區(qū)結締組織增生，造模8周形成明顯的假小葉結構，大量膠原纖維和細胞外基質形成，ALT、AST等肝功指標的明顯變化。

肝纖維化形成與多種細胞和細胞因子的動態(tài)改變密切相關，影響肝臟細胞外基質的沉積，調控著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[10]。HSC是肝臟纖維化過程中最關鍵的效應細胞，主要分布于Disse間隙內，包繞在肝竇周圍，而多種細胞因子可調控HSC的活化，是調控肝纖維化的主要手段[11]。HSC在多種細胞因子的作用下被激活，可分泌TGF-β1等細胞因子，通過自分泌進一步維持自身的活化狀態(tài)并激活臨近HSC，活化的HSC增殖，進而轉化為具有促纖維化、增生、趨化等功能的成纖維樣細胞/肌成纖維細胞[12]。α-SMA是活化的成纖維細胞的標志，參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等多種細胞外基質成分，促進肝纖維化的發(fā)生。TGF-β1是肝纖維化形成過程中的關鍵細胞因子，TGF-β1信號通路的激活能促進肝損傷、炎癥因子的產生及HSC的活化，也可通過誘導肝細胞的凋亡和抑制肝細胞增生促進肝纖維化的產生[13]。所以近年來TGF-β1及其Smad信號通路和α-SMA等成為纖維化疾病研究的熱點，該信號通路在肝臟纖維化進程中發(fā)揮了重要作用。研究通過實驗證實在肝臟纖維化過程中α-SMA和TGF-β1表達，并伴隨纖維化程度的加重而表達逐漸增多，說明α-SMA和TGF-β1與肝臟纖維化的形成密切相關。α-SMA和TGF-β1表達呈現(xiàn)正相關性也可說明TGF-β1的分泌能夠活化HSC，刺激成纖維樣細胞的增殖，加強α-SMA的表達。

總之，α-SMA和TGF-β1是肝臟纖維化形成過程中重要細胞因子，并可能協(xié)同參與肝臟纖維化的形成，因此抑制α-SMA和TGF-β1的表達或阻斷相應細胞信號通路都將為臨床肝臟纖維化治療提供理論依據(jù)。

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Expression and Relationship between α-SMA and TGF-β1 in Rat Liver Fibrosis Model

Yuan Dongwei，Liu Qiujin，Liu Hongrui，Wang Xiaoya，Zhang Jiaren，F(xiàn)an Wenlu
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To make clear the effect and relationship between α-SMA and TGF-β1 in liver fibrosis，intraperitoneal injection of CCl4was usedto make liver fibrosis model in rats，and then histopathological changes were detectedand α-SMA and TGF-β1were expressedby histopathological method，immunohistochemistry and proteomics method in the process of liver fibrosis.The results showed that the model was successfully built and pathological characteristics were obviously observed.The expression of α-SMA and TGF-β1 was positive and showedpositively correlated with liver fibrosis process.α-SMA and TGF-β1 were important cytokines which could promote the liver fibrosis process，and mightcooperate in formation of liver fibrosis.

liver fibrosis；CCl4；α-SMA；TGF-β1；rat

S852.34

A

1002-2090（2017）05-0033-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.009

2017-04-13

黑龍江八一農墾大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（xc2014020）。

原冬偉（1980-），男，講師，韓國國立慶北大學獸醫(yī)科大學，現(xiàn)主要從事動物疾病病理機制及診斷方面的研究工作。