裸鼠乳腺腫瘤生長過程中電特性的在體測量實驗研究*

曹爽，張巖，馬任，張順起，殷濤，劉志朋

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津300192）

1 引 言

美國癌癥研究協(xié)會2017年癌癥進展報告表明，癌癥已成為世界范圍內(nèi)致死率第二位的公共衛(wèi)生問題。每年大約170萬人新被診斷為癌癥，有約60萬人因為癌癥去世［1］。研究表明，癌癥早期治愈率高達百分之八十［2］，為了對癌癥患者進行早期干預治療，提高長期生存率，癌癥的早期診斷和篩查成為醫(yī)學上亟需解決的問題。生物組織的電導率和介電常數(shù)作為與頻率相關的電特性，隨生物組織生理、病理狀態(tài)的變化而變化。已有臨床醫(yī)學研究表明，在癌變的早期階段，電特性變化早于其結構變化［3］。因此，根據(jù)生物組織的電特性診斷早期癌癥具有可行性［4］。

目前，生物組織電特性測量的研究多數(shù)來自于離體生物組織的直接測量和在體組織電特性成像［4-7］。其中，離體生物組織的電特性數(shù)據(jù)，由于組織含水量發(fā)生了變化，與在體的真實電特性存在一定的偏差［8］。因此，建立生物組織（腫瘤組織和正常組織）在體的電特性數(shù)據(jù)庫對癌癥早期檢測和組織電特性成像尤其重要。對于生物組織電特性數(shù)據(jù)的在體測量來說，探頭的尺寸是影響測量實施的一個重要因素。傳統(tǒng)的組織電特性測量探頭尺寸較大，較難實現(xiàn)在體測量。本研究采用自制的小尺寸探頭對生物組織（乳腺癌組織和正常組織）的電導率及介電常數(shù)進行在體測量（頻率范圍：0.5～5 MHz），并且對腫瘤不同發(fā)展階段的電特性數(shù)據(jù)進行分析。

2 材料與方法

2.1 自制探頭參數(shù)

本研究采用自制的小尺寸探頭，探頭的尖端測量圓環(huán)直徑為1 mm，與被測生物組織的接觸體積僅為0.25πmm3。探頭分為測量電極、保護電極和電極支架三個部分，結構見圖1。其中，電極（測量電極、保護電極）和電極支架均采用生物相容性良好的材料。電極板厚度約為0.5 mm，寬度為10 mm，兩測量電極板平行相對。其中，保護電極為內(nèi)徑0.51 mm，外徑1 mm的圓環(huán)，與被保護電極處于同一個電極板平面，在測量中可以消除畸變電場。

2.2 裸鼠乳腺癌模型

40只BLAC/c裸鼠，雌性，4～6周齡，體重16±1 g，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)一周。乳腺癌細胞MDA-MB-231在含有10%的胎牛血清和1%的抗生素中培養(yǎng)。癌細胞培養(yǎng)至濃度為1×106/mL時，注射入裸鼠右側第二對乳腺脂肪墊內(nèi)。將種植有乳腺癌的裸鼠飼養(yǎng)在SPF級的飼養(yǎng)盒中，每天觀察記錄裸鼠生命體征，分別于種植后7、14、21、28 d隨機選取10只裸鼠進行電特性測量，分別按腫瘤生長時間依次標記為 A、B、C、D四組（A組：7d；B組：14d；C組：21d；D組：28d）。全部實驗完成后，處死裸鼠。

2.3 電導率及介電常數(shù)的測量步驟

測量前，測量記錄裸鼠體溫、體重。裸鼠腫瘤尺寸、形狀等信息由醫(yī)用超聲儀器進行檢測，測量示意見圖2a。根據(jù)醫(yī)用超聲結果，在腫瘤表面沿2只乳腺所在直線標記測量點，每隔2 mm標記一個點，測量點標記示意見圖2b。在醫(yī)用超聲的指引下，采用小尺寸探頭逐點測量裸鼠腫瘤的電特性，探頭測量示意見圖2c。自制探頭另一端連接阻抗分析儀（安捷倫4294A），測量頻率為0.5～5 MHz，測量前對阻抗分析儀及小尺寸探頭進行校準，標準液選用甲醇、乙醇及飽和NaCl溶液［9］。為了區(qū)分癌癥組織及正常組織，本研究對裸鼠肌肉組織、肝臟組織、脂肪組織進行了在體測量。同時，本研究對離體2 h的腫瘤組織和脂肪組織進行了測量。

2.4 組織病理學檢測

對每組乳腺癌組織進行病理學檢測，確定腫瘤內(nèi)癌細胞發(fā)展情況。本研究選取裸鼠腫瘤的測量點所在縱向剖面進行病理學檢測。

圖1 微型探頭的結構圖示Fig 1 The structure of the microscope

圖2 電導率及介電常數(shù)測量示意圖a.超聲測量；b.腫瘤測量點標記；c.小尺寸探頭測量腫瘤電特性Fig 2 Measurements of conductivity and permittivity a.Measurements of the ultrasound；b.Mark the cancer measure points c.EPs measurements of cancer using the microprobe

3 結果

3.1 裸鼠體重及體溫信息

40只長有乳腺癌腫瘤的裸鼠在生長過程中的體重及體溫變化見圖3。在癌癥發(fā)展過程的前三周（A、B、C組），裸鼠體重逐漸上升，在第四周（D組）體重下降；裸鼠體溫逐漸下降。

圖3 裸鼠體重及體溫變化（7～28 d）a.體重；b.體溫Fig 3 Body weight and temperature changes of mice（7～28 days）a.Body weight；b.Temperature

3.2 超聲檢測結果

四組超聲檢測的腫瘤尺寸見表1，腫瘤尺寸變化見圖4，尺寸數(shù)據(jù)由±s標記（x為平均值，s為標準差）。其中，腫瘤尺寸由其長軸長度×短軸長度（正面、側面取平均值）標記。在癌癥發(fā)展的過程中，腫瘤尺寸逐漸增大，前三周（A、B、C組）增速接近一致，從第四周開始，腫瘤尺寸增長速度變慢。

表1 腫瘤尺寸（±s）Table 1 Size of the tumors（±s）

表1 腫瘤尺寸（±s）Table 1 Size of the tumors（±s）

組別 長軸/mm 短軸/mm A 15.77±3.81 6.84±1.37 B 24.54±4.13 12.59±1.95 C 29.34±2.38 18.33±2.91 D 31.03±2.80 18.96±2.53

圖4 癌癥發(fā)展過程中腫瘤尺寸變化Fig 4 Tumor size changes during cancer progression

3.3 腫瘤在體-離體電特性結果

40只裸鼠乳腺腫瘤組織和脂肪組織在體、離體（2 h）電導率及介電常數(shù)的對比分別見圖5a、圖5b。腫瘤組織的在體與離體數(shù)據(jù)存在顯著差異（P＜0.01）；脂肪組織的在體與離體數(shù)據(jù)無差異性（圖中曲線近似重合）。

圖5 腫瘤組織和脂肪組織在體-離體電特性a.電導率；b.介電常數(shù)Fig 5 EPs of tumors and fats（in-vivo vs.ex-vivo）a.Conductivity；b.Permittivity

3.4 腫瘤組織與正常組織電特性結果

40只裸鼠乳腺腫瘤組織、脂肪組織、肌肉組織在頻率0.5、1、5 MHz處電導率及介電常數(shù)的對比分別見圖6a、圖6b。在所選取的三個特征頻率點處，癌癥組織的電導率、介電常數(shù)與肌肉組織的電導率、介電常數(shù)存在顯著差異（P＜0.01）；癌癥組織的電導率、介電常數(shù)與脂肪組織的電導率、介電常數(shù)存在顯著差異（P＜0.01）；肌肉組織與脂肪組織差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 腫瘤組織與脂肪組織、肌肉組織電特性對比（0.5、1、5 MHz）a.電導率；b.介電常數(shù)Fig 6 EPs comparison of tumor with adipose and muscle tissues（0.5、1、5 MHz）a.Conductivity；b.Permittivity

3.5 腫瘤發(fā)展過程中電特性變化結果

40只裸鼠種植乳腺癌腫瘤后放在相同環(huán)境（SPF級）中飼養(yǎng)，在腫瘤種植后的第7 d，隨機選取10只，進行乳腺腫瘤的電特性測量，標記為A組；隨后每隔7 d隨機選取10只進行一次測量，分別標記為 B、C、D組（14d-B組；21d-C組；28d-D組）。A-D組裸鼠乳腺癌電特性對比見圖7。在腫瘤發(fā)展的第1～4周，腫瘤的電導率及介電常數(shù)逐漸增大，增速逐漸變慢。腫瘤組織的電導率和介電常數(shù)在早期，即1～2周增長迅速，成倍數(shù)增長，第3～4周則增長緩慢。

3.6 病理結果

對40只裸鼠乳腺癌組織病理學分析。在乳腺癌發(fā)展的第1～4周（A-D組）中每周選取2只裸鼠做病理切片。每周乳腺癌組織的病理結果見圖8。在裸鼠乳腺癌發(fā)展的第1周（W1），腫瘤界限清楚，腫瘤細胞不規(guī)則，切片區(qū)域可見中性粒細胞；第2周（W2），腫瘤部分界限清楚，腫瘤細胞不規(guī)則、梭形，彌漫生長，腫瘤內(nèi)可見稀疏血管；第3周（W3），腫瘤界限不清楚，切片區(qū)域可見壞死區(qū)，腫瘤內(nèi)可見較多不規(guī)則血管，切片區(qū)域可見腫瘤內(nèi)出血；第4周（W4），腫瘤內(nèi)出現(xiàn)大片狀壞死，可見大量不規(guī)則血管，切片區(qū)域有大量內(nèi)出血。

圖7 腫瘤發(fā)展過程1～4周（A-D組）電特性變化a.電導率；b.介電常數(shù)Fig 7 Changes in the EPs of the tumor during the 1～4 weeks（A-D group）a.Conductivity；b.Permittivity

圖8 腫瘤發(fā)展過程1～4周（A-D組）病理切片F(xiàn)ig 8 Pathological sections of the tumor during the 1～4 weeks（A-D group）

4 討論

近年來，國內(nèi)眾多報道聚焦于生物組織真實電特性數(shù)據(jù)的研究［8，10］，但仍未得到令人滿意的結果，原因是生物組織真實電特性的測量結果受生物組織樣本狀態(tài)及測量條件等多因素的影響［11］。其中，離體測量對測量結果的影響較大，原因是組織離體后細胞的含水量、溫度等與在體相比均發(fā)生了明顯變化［12，13］。當生物組織從生物體切下后，其組織的穩(wěn)定性與在體相比有所下降，并且這種下降隨著組織離體時間的增加而增加［14］。因此，在體測量是獲取生物組織真實電特性的最好方法。另外，組織與測量探頭接觸是否緊密對測量結果也有影響。目前已有的測量探頭普遍適用于離體組織，并且有特定的樣本制備要求，這就對生物組織的真實形態(tài)造成了破壞，從而對測量結果產(chǎn)生了影響。因此，本研究自制了小尺寸刺入式電特性測量探頭，并且采用該探頭在0.5～5 MHz頻率范圍內(nèi)對正常脂肪組織、肌肉組織及乳腺腫瘤組織的電特性進行了在體測量，得到了該低頻率范圍內(nèi)生物組織的在體電導率和介電常數(shù)。通過對測量數(shù)據(jù)的分析表明，用該探頭測量所得的離體、在體生物組織電特性數(shù)據(jù)存在差異（P＜0.01）。

生物組織的電特性具有分布不均勻性及頻率-溫度依賴性。其中，分布不均勻性的原因是生物體內(nèi)細胞種類、密度、細胞膜性結構、內(nèi)外電解液成分和濃度不同，進而導致組織含水量不同，最終導致生物體內(nèi)各組織的電特性不同，同一組織不同部位的電特性也不相同［15］。由此，可推斷在組織癌變的早期階段，由于組織細胞含水量和細胞電解液含量發(fā)生改變，導致組織電特性與正常組織存在明顯差異［3，16-17］。目前，根據(jù)組織電特性變化診斷早期癌癥是一個研究熱點［14，18］。本研究采用小尺寸探頭對裸鼠乳腺癌組織測量的平均電導率比肌肉組織高出4.6倍（P＜0.01），而比脂肪組織則高出9倍（P＜0.01）；乳腺癌組織的平均介電常數(shù)比肌肉組織高出23倍（P＜0.01），而比脂肪組織高出46倍（P＜0.01）。從該結果中可以看出，癌癥組織的電特性均高于正常組織，這就為應用電特性診斷早期乳腺癌提供了數(shù)據(jù)支持。

為了進一步探究如何利用組織電特性數(shù)據(jù)鑒別早期癌癥，研究了組織癌變過程中電特性的變化，對裸鼠乳腺癌不同生長時期的電特性進行分階段、分組測量，得出隨著乳腺癌的發(fā)展，乳腺組織的電導率和介電常數(shù)均逐漸增大，增長率則逐漸降低，說明在乳腺癌發(fā)展的早期階段，乳腺癌組織的電導率和介電常數(shù)變化較快，該結果與病理結果相吻合，這也為應用電導率和介電常數(shù)診斷早期癌癥提供了依據(jù)。本研究自制的探頭尺寸較?。ㄓ行Ы佑|體積0.25π mm3），對組織破壞小，因此可以對組織實施微創(chuàng)檢測。本研究的局限性是實驗中所制備的裸鼠乳腺癌模型為種植模型，其對于癌癥真實的發(fā)展過程還原度較誘導模型低，下一步的實驗應對誘導模型的電特性加以研究，進而總結誘導乳腺癌模型和種植乳腺癌模型在電特性上的差別。

5 結論

本研究采用自制小尺寸探頭在體測量裸鼠乳腺癌的發(fā)展過程中的電特性參數(shù)。測量了裸鼠乳腺癌不同發(fā)展階段電特性的在體數(shù)據(jù)，并與離體電特性數(shù)據(jù)及正常組織的電特性數(shù)據(jù)進行了對比，為今后應用電特性診斷早期癌癥奠定了基礎。