一株薄荷抑菌內(nèi)生菌鑒定與抑菌活性分析

張艷翠+謝秋姣+朱衛(wèi)平+陳東紅

摘要 從薄荷里篩選出一株具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌（命名為BH2），通過對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析，表明該菌株屬于解淀粉芽孢桿菌。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、未知霉菌均有抑菌活性。

關(guān)鍵詞 薄荷；內(nèi)生細(xì)菌；解淀粉芽孢桿菌；抑菌活性

中圖分類號(hào) S681.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）17-0068-02

Identification and Antibiotic Activity of an Endophytic Bacterium in Mentha haplocalx Briq

ZHANG Yan-cui XIE Qiu-jiao ZHU Wei-ping CHEN Dong-hong *

（School of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract An endophytic bacterium named BH2 with antibiotic activity from Mentha haplocalx Briq was screened.Morphological observation and 16S rDNA sequence analysis indicated that BH2 belong to Bacillus amyloliquefaciens.Antimicrobial experiments showed BH2 can inhibit the growth of Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus and an unknown fungus.

Key words Mentha haplocalx Briq；endophytic bacterium；Bacillus amyloliquefaciens；antibiotic activity

薄荷（Mentha haplocalx Briq）為唇形科一年生藥食兩用植物，其揮發(fā)油經(jīng)加工后得到的薄荷腦等被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、香料、煙草等工業(yè)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，薄荷對(duì)治療癌癥有特殊功效，薄荷油還具有一定的抗菌活性，其內(nèi)生真菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化中通過基因交流，代謝產(chǎn)物也具備一定的抑菌效果，作為生物抑菌劑具有巨大的開發(fā)潛力。

植物內(nèi)生細(xì)菌（endophyte）是指定殖在健康植物組織內(nèi)，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物[2]。隨著對(duì)其深入的研究，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，定殖后的內(nèi)生細(xì)菌可起固氮作用，可分泌植物促生物質(zhì)，對(duì)病蟲害起生防作用。引起了微生物學(xué)家、生態(tài)學(xué)家、植病學(xué)家的廣泛興趣，近年來成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[3]。自1993年以來，人們從多種藥用植物中陸續(xù)分離出產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生菌，藥用植物內(nèi)生菌已成為人們尋找新型骨架化合物藥物的重要來源，并具有不可替代的優(yōu)勢(shì)[4]。

近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)薄荷內(nèi)生菌的研究主要是內(nèi)生真菌方面，集中研究的有薄荷內(nèi)生真菌的多樣性及組分的分析、內(nèi)生真菌對(duì)薄荷自身生長(zhǎng)、揮發(fā)油、精油的影響以及生物防治作用等[5]。此外，薄荷內(nèi)生細(xì)菌僅僅在種類多樣性的探究，在生物防治方面的研究很少，而生物防治與人類生活、健康及環(huán)境保護(hù)息息相關(guān)[6]。細(xì)菌較真菌繁殖周期短，實(shí)驗(yàn)周期短，若能篩選出抑菌性較好的薄荷內(nèi)生細(xì)菌，分離其代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，并對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行篩選鑒定，可能在生物防治方面會(huì)有一定的突破。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

薄荷采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。抑菌試驗(yàn)用敏感指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus sub-tilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、未知霉菌。培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離與純化。按常規(guī)的無菌操作方法，用組織分離法取薄荷新鮮葉及幼嫩莖，按下列程序表面消毒：自來水沖洗后先后經(jīng)70%酒精漂洗30 s，0.6%過氧化鈉漂洗5 min，無菌水沖洗3～5次。將經(jīng)過處理的樣品在無菌條件下切割成小塊，接種于PDA固體培養(yǎng)基上；一部分切割的小塊在滅菌的研缽中進(jìn)行研磨并加1 mL水混勻，取適量于LB培養(yǎng)基中并涂布均勻。每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)平行組，以最后一次清洗無菌水作對(duì)照，于28 ℃溫箱倒置培養(yǎng)1周。

1.2.2 抑菌性內(nèi)生菌的篩選。①平板對(duì)峙培養(yǎng)法。針對(duì)指示菌為病原菌，吸取病原菌菌液200 μL于LB固體培養(yǎng)基平板中心，吸取200 μL待測(cè)菌液于其周圍同等距離處點(diǎn)3 處，于28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿后觀察抑菌效果。②濾紙片法。指示菌與無菌水1∶100混合后取200 μL于LB固體培養(yǎng)基中涂勻。將BH2菌株發(fā)酵液在4 ℃下以6 000 r/min離心20 min，保留上清，用60%硫酸銨沉淀4 h后，在4 ℃下以8 000 r/min離心20 min，無菌細(xì)菌過濾器進(jìn)行過濾。取過濾液，用直徑6 mm的無菌濾紙浸濕，并置于平板上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿后觀察。

1.2.3 內(nèi)生菌細(xì)菌的鑒定。①形態(tài)學(xué)分析。將篩選具有較強(qiáng)抑菌性的菌株接種到Y(jié)EB培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞形態(tài)采用革蘭氏染色進(jìn)行觀察。②16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析。用CTAB法提取BH2基因組總DNA。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA通用引物，以基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后，送公司測(cè)序?；?6S rDNA基因序列的聚類分析，利用在線BLAST軟件在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)；選取同源性高的典型菌株的16S rDNA基因序列作為參比對(duì)象，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，然后利用MEGA6軟件中的鄰接法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄荷內(nèi)生菌的分離及抑菌測(cè)試

從薄荷莖、嫩葉中采用表面消毒方法分離內(nèi)生細(xì)菌，共分離出16株內(nèi)生細(xì)菌，分別命名為BH1～BH11。通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出1株可產(chǎn)生光譜抗性物質(zhì)的的內(nèi)生菌BH2。其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌以及未知霉菌均有不同程度的拮抗作用。通過對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨沉淀處理后進(jìn)行抑菌測(cè)試，確定抑菌物質(zhì)存在于上清液中（圖1）。

2.2 BH2菌株的鑒定

2.2.1 內(nèi)生菌的形態(tài)學(xué)觀察。在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h，BH2菌落呈現(xiàn)為白色，不透明，邊緣不規(guī)則。顯微鏡觀察顯示菌體為短桿狀，有芽孢，為革蘭氏陽性菌（圖1）。

2.2.2 16S rDNA 分子鑒定。利用 16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，得到菌株BH2的DNA序列，通過NCBI在線BLAST程序進(jìn)行同源比對(duì)搜索發(fā)現(xiàn)，BH2的16S rDNA 序列與已公布的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） 具有99%的同源性。然后通過Clustal X1.83和MEGA6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步確定 BH2與B.amylo-liquefaciens的親緣關(guān)系最近（圖2）。綜合判定內(nèi)生菌 BH2為解淀粉芽孢桿菌的一個(gè)亞種，故命名為B.amyloliquefacie-ns BH2。

3 結(jié)論與討論

薄荷具有重要的藥理價(jià)值，其富含揮發(fā)性的薄荷油成分，可用于清涼止癢、發(fā)汗解熱、促透作用、抗早孕、抗著床、抗真菌、抗病毒等；另外，其非揮發(fā)性成分可發(fā)揮保肝利膽抗腫瘤、烏發(fā)、抗氧化等功效[7]。內(nèi)生菌在與宿主之間長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過程中，經(jīng)常會(huì)與宿主之間發(fā)生基因的平行轉(zhuǎn)移，從而可能獲取部分宿主的特性甚至參與宿主的次生代謝過程。因此，對(duì)薄荷內(nèi)生菌進(jìn)行分離和研究，希望能發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)生菌資源，并開發(fā)出潛在的新的活性代謝物。本研究從薄荷中分離到一株內(nèi)生菌BH2，形態(tài)學(xué)和分子鑒定表明，BH2屬于一種新的解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌作為生防細(xì)菌的研究比較多，其能產(chǎn)生多種不同類型的抗菌物質(zhì)，如抗菌蛋白、伊枯草菌素、幾丁質(zhì)酶等，在植物病蟲害防治方面貢獻(xiàn)突出[8]。內(nèi)生菌BH2對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、霉菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用；但其合成的水溶性抗菌活性成分及相應(yīng)的生物學(xué)功能，仍需進(jìn)一步深入探討。

4 參考文獻(xiàn)

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