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    亞麻愈傷組織誘導(dǎo)和遺傳轉(zhuǎn)化體系建立

    2017-10-27 09:31李雪安勝軍邵鐵梅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年16期
    關(guān)鍵詞:愈傷組織亞麻

    李雪 安勝軍 邵鐵梅

    摘要:為了建立高效亞麻愈傷組織誘導(dǎo)體系,對亞麻的無菌苗培養(yǎng)、外植體愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織繼代擴(kuò)增3個方面進(jìn)行了研究。同時對農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞麻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明,亞麻無菌苗接種培養(yǎng)基為MSB+1 mg/L 6-BA時有利于亞麻愈傷組織出愈,適合亞麻愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA,或在此基礎(chǔ)上添加10 mg/L 2,4-D,2種培養(yǎng)基在愈傷組織誘導(dǎo)階段差別不大。愈傷組織繼代擴(kuò)增培養(yǎng)基為MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA,在此培養(yǎng)基上,愈傷組織量在25 d時達(dá)到頂峰。由抗生素抗性試驗(yàn)得出亞麻愈傷組織卡那霉素抗性臨界值為100 mg/L。亞麻愈傷組織轉(zhuǎn)化的方式為浸泡材料15 min后抽真空5 min較好,遺傳轉(zhuǎn)化率為31%。經(jīng)PCR分析驗(yàn)證,證明阿樸脂蛋白米蘭突變體外源基因已經(jīng)整合至亞麻抗性愈傷組織基因組中。

    關(guān)鍵詞:亞麻;愈傷組織;遺傳轉(zhuǎn)化

    中圖分類號: S5632043文獻(xiàn)標(biāo)志碼:

    文章編號:1002-1302(2017)16-0046-04

    收稿日期:2017-01-20

    基金項(xiàng)目:河北省教育廳高等學(xué)??茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號:ZD2014087);河北省教育廳項(xiàng)目(編號:Z2015214)。

    作者簡介:李雪(1979—),女,河北趙縣人,碩士,講師,從事植物生物反應(yīng)器的研究。E-mail:lixue712@126com。

    通信作者:安勝軍,博士,教授,從事動物細(xì)胞方面及蛋白類藥物的研究與開發(fā)。E-mail:sjsjan@126com。

    亞麻是一種古老的栽培植物,包含13個屬300個種,主要于纖維用、油用、藥用等方面。亞麻是高度自花授粉作物,常規(guī)育種方法耗時且受到遺傳資源有限和近親雜交的障礙[3],因此基因工程新技術(shù)應(yīng)用于亞麻植物上勢在必行,而基因工程新技術(shù)的發(fā)展離不開植物愈傷組織快速誘導(dǎo)體系的建立。

    自1975年至今,愈傷組織誘導(dǎo)在很多植物上均有研究,最早的有水稻[4]、楊樹[5]、甘蔗、大蒜、小麥[8]、紅豆杉[9]、大麥[10]、火龍果[11]、桑樹[12]等,且取得了成功。有關(guān)亞麻的愈傷組織誘導(dǎo)報道較少,國外亞麻組織培養(yǎng)方面的研究多集中在亞麻花藥愈傷培養(yǎng)上[13-16],操作難度大,影響因素多,且重復(fù)性差。趙瑋等發(fā)表的有關(guān)亞麻下胚軸愈傷的研究[17],在本實(shí)驗(yàn)室未能很好的重復(fù)再現(xiàn)。同一基因型不同操作手法結(jié)果的差異,限制了亞麻愈傷組織誘導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)化的發(fā)展。研究亞麻愈傷組織誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)化,目的是以愈傷組織作為植物生物反應(yīng)器原材料,轉(zhuǎn)入分泌型的外源基因,提取抗性愈傷組織的蛋白,用于后續(xù)的基因工程研究。

    本研究對亞麻品種隴亞10號下胚軸進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo),探索愈傷組織誘導(dǎo)、擴(kuò)繁增殖的條件,并建立了亞麻愈傷組織的生長曲線,初步確定了基因轉(zhuǎn)化的條件,以期建立快速生長且可重復(fù)的亞麻轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系,從而為亞麻基因轉(zhuǎn)化工程發(fā)展提供參考。

    1材料與方法

    亞麻種子隴亞10號由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

    11種子消毒方法

    挑選無破損的亞麻種子,75%乙醇消毒1 min,5%次氯酸鈉溶液消毒5 min,無菌水洗滌4次,沖洗干凈后浸泡無菌水中,置搖床上過夜萌發(fā)備用。培養(yǎng)基:所有的培養(yǎng)基均以MS[18]為基本培養(yǎng)基。

    12無菌苗種植方法

    將萌發(fā)好的種子接種于無菌苗生長培養(yǎng)基上,無菌苗生長培養(yǎng)基分別為MSB、MSB+1 mg/L 6-BA。

    13下胚軸誘導(dǎo)愈傷方法

    待無菌苗長至5~7 cm時,切其下胚軸,切為05~10 cm 的小段,分別放置下胚軸誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上。每次接種50小段,水平試驗(yàn)重復(fù)4次,使總接種量達(dá)到200小段左右。通過查閱資料,設(shè)置下胚軸誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基附加不同濃度、種類植物生長調(diào)節(jié)劑(表1)。在(25±1)℃下暗培養(yǎng)7~14 d觀察外植體的形態(tài)變化,25 d后統(tǒng)計外植體出愈率。

    14愈傷組織生長曲線的制定方法

    愈傷從誘導(dǎo)開始,中間繼代2次后得到生長旺盛的愈傷組織。以此為基礎(chǔ),相同鮮質(zhì)量09 g的愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基,共接種12瓶。暗培養(yǎng),每隔2 d取1瓶,測定愈傷組織鮮質(zhì)量,直至24 d。水平試驗(yàn)重復(fù)1次,用2次鮮質(zhì)量平均增長值制定亞麻愈傷組織生長曲線。

    15繼代擴(kuò)增愈傷組織最適培養(yǎng)基的選定方法

    篩選愈傷生長外觀及形態(tài)均相似的2種培養(yǎng)基,采用上述方法制作愈傷組織生長曲線,最終確定繼代擴(kuò)增愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

    16亞麻愈傷組織對抗生素的敏感性試驗(yàn)

    含卡那霉素的培養(yǎng)基制備,分別為卡那霉素10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L處理各3瓶,共30瓶,則為3個重復(fù)試驗(yàn)。每瓶均接種鮮質(zhì)量1 g生長旺盛的愈傷組織,25 d后測量每瓶的鮮質(zhì)量增長量,選取鮮質(zhì)量未增長且減少的同一組處理,為愈傷組織的卡那霉素抗性臨界值。

    17外源基因基于愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法

    阿樸脂蛋白米蘭突變體基因命名為TA,含NPTII報告基因的質(zhì)粒雙元表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)中心構(gòu)建提供。侵染方法、時間等見表2。

    注:農(nóng)桿菌D值均為04~06。[HT][FK)]

    侵染后,共培養(yǎng)3 d、抑菌培養(yǎng)7 d,抑菌用頭孢噻肟鈉工作濃度為300 mg/L。然后進(jìn)入培養(yǎng)基抗性篩選階段。

    18抗性愈傷組織的繼代培養(yǎng)及PCR鑒定

    選取抗性愈傷繼代3次,確定無農(nóng)桿菌污染后,進(jìn)行外源基因PCR分析。提取抗性愈傷的基因組DNA,以未轉(zhuǎn)化的普通愈傷組織基因組DNA為陰性對照,阿樸脂蛋白米蘭突變體基因的質(zhì)粒為陽性對照。設(shè)計阿樸脂蛋白米蘭突變體基因的擴(kuò)增引物,引物命名為:endprint

    其中1、2擴(kuò)增阿樸脂蛋白的目的片段長度為750 bp,2、3擴(kuò)增阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽的長度為840 bp,4、5擴(kuò)增阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽、啟動子后的總長為 2 070 bp。

    擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min、95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 50 s、72 ℃ 10 min,30個循環(huán)。反應(yīng)完成后,采用 14%~16%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

    2結(jié)果與分析

    21亞麻外植體培養(yǎng)

    無菌苗生長的2種培養(yǎng)基,添加6-BA的培養(yǎng)基上無菌苗下胚軸不僅外觀形態(tài)較未添加的粗短,而且下胚軸誘導(dǎo)出愈時間較未添加的早,因此在誘導(dǎo)愈傷組織的外植體培養(yǎng)上,應(yīng)選擇添加6-BA細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基。

    22誘導(dǎo)愈傷

    接種在不同培養(yǎng)基上的外植體出愈率、出根率、愈傷表披白霜率等見表3,采用DPS數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明,出愈率方面,培養(yǎng)基A5、A10與其他13種培養(yǎng)基有顯著差異,而這13種培養(yǎng)基間沒有明顯差異,出愈率均較高。在出芽率方面,幾種培養(yǎng)基間差異較大,其中A8、A9、A10培養(yǎng)基沒有芽發(fā)生,A2、A7、A14培養(yǎng)基芽發(fā)生率較低,芽發(fā)生率最高的為A4培養(yǎng)基。出根率,幾種培養(yǎng)基間也有顯著差異。A7、A8、A9、A10培養(yǎng)基沒有根發(fā)生,A2、A5、A14培養(yǎng)基根發(fā)生率較低,生根率最高的為A1培養(yǎng)基。愈傷表披白霜率方面,A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14培養(yǎng)基上的愈傷組織沒有出現(xiàn)白霜,A7培養(yǎng)基上的愈傷組織白霜率最高。15種培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色呈現(xiàn)2種,分別為黃色、黃白色,愈傷組織顏色好的培養(yǎng)基為A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14,不好的培養(yǎng)基為A7、A8、A9、A10。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織狀態(tài),是衡量培養(yǎng)基合適與否的一個重要指標(biāo),從表3可以看出,A2、A14培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織狀態(tài)最好,A7、A8、A9、A10培養(yǎng)基培養(yǎng)愈傷組織的狀態(tài)最差。綜合考慮各方面因素,亞麻誘導(dǎo)愈傷組織適合的培養(yǎng)基為A2、A14。

    23愈傷組織生長曲線的制定

    由不同培養(yǎng)天數(shù)亞麻愈傷組織的鮮質(zhì)量增殖量,建立了亞麻愈傷組織的生長曲線(圖1),2種培養(yǎng)基愈傷組織的生長曲線均呈S形。從亞麻的愈傷組織生長曲線可以看出,2種培養(yǎng)基上的愈傷組織在0~7 d時呈現(xiàn)緩慢生長。從7 d開始,A2培養(yǎng)基上的愈傷進(jìn)入快速增長期,至25 d達(dá)到頂峰,25 d后愈傷組織生長量開始下降。A14培養(yǎng)基上的愈傷組織,從7 d開始也進(jìn)入快速增長期,至28 d時達(dá)到頂峰,但 17~28 d期間,愈傷組織呈現(xiàn)平穩(wěn)緩慢增長,28 d后愈傷組織生長量開始下降。從圖1可以看出,A2、A14 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織生長達(dá)到頂峰時的愈傷組織增長量和時間有明顯的差異,A2培養(yǎng)基明顯優(yōu)于A14培養(yǎng)基,因此選定A2培養(yǎng)基為亞麻愈傷組織繼代擴(kuò)增的最適培養(yǎng)基。

    24卡那霉素臨界濃度值確定

    從圖2可以看出,卡那霉素的濃度變化對亞麻愈傷組織的增殖量有明顯的抑制作用。隨著卡那霉素的濃度增加,亞麻愈傷組織生長的增殖量會相應(yīng)減少。當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到

    100 mg/L 時,亞麻愈傷組織出現(xiàn)了負(fù)增長的現(xiàn)象,即25 d后亞麻愈傷組織鮮質(zhì)量比初接種時鮮質(zhì)量減少了021 g,因此,當(dāng)侵染亞麻愈傷組織時,卡那霉素100 mg/L為抗性篩選濃度。

    [FK(W11][TPLX2tif][FK)]

    25愈傷組織的轉(zhuǎn)化分析

    從表4可以看出,7種侵染方式中,只有A、B、D 3種方式能夠得到抗性愈傷,且侵染后愈傷組織的顏色會有差別。農(nóng)桿菌與愈傷組織浸泡過夜后得到的愈傷均為灰白色,其他2種方式得到的愈傷組織為黃褐色和紅褐色。其中,抗性愈傷能夠在褐色愈傷組織上生長出白色愈傷組織(圖3)。A、B、D 3種方式的轉(zhuǎn)化率各不相同,以B方式最高,為31%。而A、D 2種方式的轉(zhuǎn)化率分別為267%、164%。因此,在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化亞麻愈傷組織時,適宜采用B方式轉(zhuǎn)化,即對受體材料采取農(nóng)桿菌菌液浸泡15 min,然后5 min抽真空處理轉(zhuǎn)化方式較好。

    26PCR分析

    PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖4)表明,隨機(jī)選取的抗性愈傷組織均擴(kuò)增到和陽性對照質(zhì)粒同樣大小的片段。阿樸脂蛋白的目的片段長度為750 bp,阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽的長度為 840 bp,阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽、啟動子后的總長為2 070 bp,樣品和質(zhì)粒陽性對照片段大小均一致,且由于提取基因組DNA的樣品為經(jīng)過3次繼代后的抗性愈傷組織材料,表明外源基因已經(jīng)隨機(jī)整合到亞麻愈傷組織基因組DNA中,且穩(wěn)定遺傳。

    3討論與結(jié)論

    本研究在無菌苗培養(yǎng)階段,加入了植物生長調(diào)節(jié)劑,結(jié)果縮短了亞麻下胚軸的出愈時間,為獲得基因轉(zhuǎn)化的原材料節(jié)約了時間,以便能快速得到轉(zhuǎn)基因抗性材料,目前,還未見亞麻組培愈傷組織誘導(dǎo)在無菌苗培養(yǎng)階段進(jìn)行處理的報道。

    Horsch等在植物轉(zhuǎn)化上采用了葉片浸泡法[18],本研究選擇的是愈傷組織浸泡、超聲或抽真空處理的轉(zhuǎn)化方法,這在愈傷組織轉(zhuǎn)化上屬于新創(chuàng)。本研究發(fā)現(xiàn)抽真空處理提高了愈傷組織的轉(zhuǎn)化率,但總體來說愈傷組織轉(zhuǎn)化率偏低,因此,提高愈傷組織轉(zhuǎn)化率方法還有待繼續(xù)研究。

    選擇標(biāo)記基因最早于1989年,McHughen將選擇標(biāo)記基因應(yīng)用在亞麻植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化中,并且獲得了成功[19]。本研究起初設(shè)計了潮霉素抗性基因,鑒于植物愈傷組織量大且使用抗生素造價問題,所以再次設(shè)計了卡那霉素抗性基因。同時,選擇標(biāo)記基因的臨界濃度值對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的篩選至關(guān)重要,植物愈傷組織抗生素抗性臨界濃度值的確定不直觀,為了得到準(zhǔn)確的愈傷組織抗生素抗性臨界濃度值,本研究采取了定期稱量愈傷組織增殖量的方法,多次重復(fù)以得到精準(zhǔn)的卡那霉素抗性臨界濃度值,期望在以后研究出簡單實(shí)用適合植物愈傷組織篩選的抗生素濃度確定方法。endprint

    在進(jìn)行PCR分析時,一般僅需擴(kuò)增轉(zhuǎn)入外源基因的目的片段即可,但在本試驗(yàn)設(shè)計時,為了減少擴(kuò)增結(jié)果假陽性的概率,同時進(jìn)行了阿樸脂蛋白目的片段、阿樸脂蛋白目的片段和連接的信號肽、阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽和啟動子,層層遞進(jìn)式擴(kuò)增,最終證明整個表達(dá)盒已經(jīng)整合進(jìn)抗性愈傷組織的基因組DNA中,保證了本試驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

    本研究以隴亞10號下胚軸為外植體,摸索到適合隴亞10號愈傷誘導(dǎo)和繼代擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)基,建立了隴亞10號高效愈傷組織誘導(dǎo)體系。以愈傷組織為受體材料,研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化條件,確定了轉(zhuǎn)化愈傷組織最佳的農(nóng)桿菌侵染時間和方式,而且篩選到合適的抗生素臨界濃度。同時采用抗生素篩選和PCR電泳檢測雙重驗(yàn)證了外源基因于愈傷組織基因組DNA中的整合。

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