瘦素及瘦素受體與乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究

張志寧, 趙亞恒, 鄭麗華，劉運江

肥胖與癌癥的關(guān)系已經(jīng)成為社會流行病學中健康問題的研究重點，WHO報道目前世界上至少有4億肥胖人群，2015年肥胖人群數(shù)目將突破7億[1]。肥胖或體重超標是乳腺癌發(fā)生的高危因素，也是腫瘤預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。根據(jù)美國的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，肥胖人群的腫瘤死亡率比正常體重人群高出52%(男性)和62%(女性)[2]。瘦素可以調(diào)節(jié)食物攝取和能量平衡，通常情況下瘦素通過下丘腦介導作用抑制食物攝入，抑制脂肪生成，促進脂肪消耗。當機體產(chǎn)生對瘦素抵抗時，脂肪合成增加，消耗減少，使機體儲存更多的脂肪；同時脂肪組織會分泌更多的瘦素，從而形成惡性循環(huán)。乳腺癌發(fā)病率逐年上升，2013年數(shù)據(jù)顯示乳腺癌成為20～59歲女性癌癥患者最主要的死亡原因[1]。本研究探討瘦素及瘦素受體與乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為預(yù)防乳腺癌提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例為2013年2月至2013年6月由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心收治，均為女性，均經(jīng)病理確診。良性乳腺疾病98例作為對照組，年齡(43.9±6.9)歲，包括乳腺腺病、乳腺炎、乳腺纖維瘤、導管內(nèi)乳頭狀瘤、炎性肉芽腫等。乳腺癌97例為研究組，年齡(45.5±6.0)歲，并按腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)多少分為A組(無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)19例；B組(1～3個腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)19例；C組(4～9個腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)19例；D組(9個以上腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)20例；E組(遠處轉(zhuǎn)移)20例。組間年齡無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

1.2 主要實驗儀器及試劑

1.2.1 實驗儀器 (1)石蠟切片機(德國LEICA公司RM2255型)；(2)攤片烤片機(孝感市泰康公司)；(3)自動染色儀(德國LEICA公司ST5020型)；(4)全自動免疫組化染色儀(美國LAB VISION AUTOSTAINER480型)；(5)光密度值測試儀器(LEICA DM3000 B and IMAGE-INPLUS)；(6)ELISA 設(shè)備(GENE Bio-Teck ELX800)。

1.2.2 實驗試劑 (1)SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；(2)瘦素ELISA試劑盒(美國Abcan公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 身高與體重的測量 所有患者均于住院第1天晨起后，空腹測量身高、體重，并記錄。

1.3.2 血清中瘦素的測量 乳腺癌患者均于清晨8點抽取空腹靜脈血,于1 h內(nèi)置冷凍離心機內(nèi)分離血清 (3 000 r/min, 離心 10 min), 置-80 ℃保存，成批測量。取出瘦素ELISA試劑盒所需反應(yīng)板，分別加入15 μl標準品、質(zhì)控、血清樣品于相應(yīng)孔中；每孔加入100 μl緩沖液，輕輕混勻30 s，37 ℃孵育120 min；洗板：甩盡版內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板(每孔加入350 μl洗滌液)，去除水滴，在厚疊吸水紙上排干；反復洗滌3次；加一抗及酶標抗體工作液：每孔加入一抗工作液100 μl，將反應(yīng)板充分混勻后，置37 ℃恒溫箱，孵育120 min，用前述洗板方法洗板，加入酶標抗體工作液100 μl，再次37 ℃靜置120 min，再次洗板；顯色：每孔加入底物工作液100 μl，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min終止；每孔加入終止液100 μl混勻。

1.3.3 石蠟標本的S-P染色及其光密度值測量 患者術(shù)后或穿刺后組織立即進行石蠟固定，待成批測定, 避免產(chǎn)生批間誤差。石蠟切片，常規(guī)脫蠟；3% H2O2去離子水孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 min(如需采用抗原修復，在此步驟后進行)；滴加封閉用正常山羊血清工作液室溫孵育10～15 min，傾去, 勿洗；滴加適當比例稀釋的一抗，37 ℃孵育2～3 h或4 ℃過夜；PBS 沖洗，3 min×3次；滴加生物素化二抗工作液(IgG / Bio)，室溫或37 ℃；PBS 沖洗，3 min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫或37 ℃；PBS 沖洗，3 min×3 次；顯色劑顯色(DAB或AEC) ；自來水充分沖洗；選擇適當?shù)姆馄瑒┓馄?，進行光密度值測定。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，MVD數(shù)值用Mean±SD表示，組間數(shù)據(jù)采用秩和檢驗，所有統(tǒng)計結(jié)果的判定，以a<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 良性乳腺疾病患者與乳腺癌患者的BMI比較

乳腺癌患者的BMI為(25.77±4.12 )kg/m2，明顯高于良性乳腺疾病患者的(24.36±3.74)kg/m2，P=0.028；肥胖患者相對于非肥胖患者患乳腺癌的相對危險度(RR)為1.44(表1)。

表1 肥胖與非肥胖患者的比例

2.2 瘦素在乳腺癌組織中的表達

瘦素在乳腺癌組織中的表達隨腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)增多而依次升高，各組間比較只有B組與C組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.188)，其余各組間均有統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 瘦素在乳腺癌組織中的表達

2.3 瘦素受體在乳腺癌組織中的表達

瘦素受體在癌組織中的表達隨腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)增多而依次升高，各組間只有B組與C組(P=0.083)、C組與D組(P=0.379)之間差異無統(tǒng)計學意義，其余各組間均有統(tǒng)計學意義(表3)。

表3 瘦素受體在乳腺癌組織中的表達

2.4 瘦素在乳腺癌組血清中的表達

瘦素在乳腺癌患者血清中的表達依次升高。各組間比較只有D組和E組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.329)，其余各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(表4)。

表4 瘦素在乳腺癌患者血清中的表達

3 討論

在機體處于病理狀態(tài)下，肥胖的發(fā)生與瘦素密切相關(guān)，同時脂肪細胞分泌瘦素，二者之間構(gòu)成反饋調(diào)節(jié)體系，起到相互促進的作用，同時瘦素的增加又可以誘導一系列致癌信號的激活，從而促進癌癥的發(fā)生、發(fā)展[2]。研究表明肥胖患者中瘦素水平增高是乳腺癌發(fā)病的危險因素，并且瘦素增高是乳腺癌預(yù)后不良的因素之一[3]。

瘦素是脂肪基因產(chǎn)生的多肽激素，是調(diào)節(jié)體重和身體組成的重要調(diào)節(jié)因素。血清中的瘦素通過下丘腦起到調(diào)節(jié)食欲及控制體重的作用。瘦素主要從脂肪細胞中分泌。偏瘦或者體重指數(shù)正常的女性對瘦素敏感性很強，瘦素通過作用于下丘腦來調(diào)節(jié)食欲及脂肪量，因此瘦素以前被認為能降低體重和肥胖。但是最近的研究表明肥胖女性的血清瘦素水平較高，導致下丘腦對瘦素無應(yīng)答，不能夠再調(diào)節(jié)體重及食欲，因此肥胖是瘦素產(chǎn)生抵抗的結(jié)果。

瘦素及瘦素受體結(jié)合后，可以被激活不同的信號轉(zhuǎn)導通路，從而促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。這些通路包括JAK/STAT、SOCS-3、PI3K和IRS蛋白途徑、瘦素和血管發(fā)生、瘦素和生長因子、瘦素與HER2、細胞周期蛋白D1和MCL-1等。瘦素及瘦素受體在正常乳腺組織中表達很少，而在乳腺癌組織卻過度表達[4]。研究表明，在瘦素或瘦素受體缺乏的小鼠中不會發(fā)生乳腺腫瘤[5]，這說明瘦素及瘦素受體在乳腺癌的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。血清中瘦素水平的增高也與乳腺癌的發(fā)生具有一定的聯(lián)系[6]。在瘦素受體缺乏的肥胖Zucker大鼠中，應(yīng)用致癌藥物甲基亞硝脲后，相對于較瘦的大鼠其乳腺癌的發(fā)病率很低[7]。而且在瘦素受體缺乏的大鼠中，用二甲基苯蒽不能誘導其患乳腺癌。導致這種結(jié)果的原因很可能是由于瘦素受體缺乏或者是由于其他尚未研究清楚的原因?qū)е碌摹?/p>

瘦素在乳腺癌組織中的表達明顯高于正常乳腺組織[8-9]，此類研究已經(jīng)很多，本實驗按腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)多少進行分組，觀察各組瘦素及瘦素受體在癌組織中表達的差異，以及在血清中瘦素的表達差異，研究瘦素及瘦素受體的表達與女性乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。另肥胖是絕經(jīng)后婦女患乳腺癌的一個高危因素，并且可以減少患者的生存率[10]，我們通過比較乳腺癌患者及良性乳腺疾病患者的BMI，評價肥胖對乳腺癌的影響。結(jié)果顯示，良性乳腺疾病患者BMI低于乳腺癌患者(P=0.028)，肥胖導致乳腺癌的相對危險因素RR=1.44，可見肥胖為乳腺癌發(fā)病的高危因素。本實驗按乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)由少到多進行分組，觀察各組瘦素及瘦素受體在癌組織中表達的差異，結(jié)果顯示，瘦素及瘦素受體在癌組織中的表達在A到E組中依次升高，證明瘦素及瘦素受體可促進乳腺癌細胞的復發(fā)、轉(zhuǎn)移。但在B、C組間無統(tǒng)計學差異，這可能是由于1～3個腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與3～9個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間危險程度相似。結(jié)果還顯示，血清中瘦素的水平D、E組間也無統(tǒng)計學差異，這可能是由于晚期患者的惡液質(zhì)造成脂肪減少從而使瘦素分泌降低造成，也可能是本實驗樣本量偏少造成。本實驗樣本量偏少，有待擴大樣本量進一步的驗證。

參考文獻：

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