不同條件制配雞紅細(xì)胞懸液對血凝-血凝抑制試驗(yàn)影響初探

姜 聰 頡煦澤 景強(qiáng)強(qiáng) 王希彩 關(guān)文怡 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京 房山 102442）

不同條件制配雞紅細(xì)胞懸液對血凝-血凝抑制試驗(yàn)影響初探

姜 聰 頡煦澤 景強(qiáng)強(qiáng) 王希彩 關(guān)文怡 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 北京 房山 102442）

新城疫血凝-血凝抑制(HA-HI)試驗(yàn)是免疫檢測最常用的方法之一，本試驗(yàn)旨在探究不同條件下制備1%雞紅細(xì)胞懸液對血凝-血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的影響。試驗(yàn)表明，母雞紅細(xì)胞懸液相對于同品種公雞對新城疫抗原更敏感；在緊急大量檢測新城疫樣品時，可以采集雞心臟血進(jìn)行快速大量制備HA-HI試驗(yàn)所需的紅細(xì)胞懸液；1%～1.5%濃度范圍的雞紅細(xì)胞懸液對HA試驗(yàn)是有效的，但要注意判讀誤差。

雞紅細(xì)胞懸液 血凝 血凝抑制 新城疫

有許多病毒能夠凝集某些動物和人的紅細(xì)胞，故可以此來檢測待檢材料中有無病毒的存在。而能凝集紅細(xì)胞的病毒，其凝集性可被相應(yīng)的抗體所抑制，這種抑制具有特異性，故病毒的血凝集抑制試驗(yàn)可用標(biāo)準(zhǔn)病毒懸液檢查被檢血清中的相應(yīng)抗體，也可用特異性抗體鑒定新分離的病毒[1]。新城疫血凝-血凝抑制試驗(yàn)是動物疫病檢疫，是免疫檢測最常用的方法之一。本試驗(yàn)根據(jù)《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)[2]標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行不同條件制配雞紅細(xì)胞懸液對血凝-血凝抑制試驗(yàn)影響對比初探，為新城疫血凝-血凝抑制試驗(yàn)檢測提供參考。

1 設(shè)備與材料

1.1 設(shè)備

普通離心機(jī)(型號TDZ4A，湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn))、微型振蕩器(型號MH-2，海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn))、DRAGON微量移液器。

1.2 試劑

雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(北京中海生物科技有限公司，批號20160517)、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原(北京中海生物科技有限公司，批號20160520)、雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(北京中海生物科技有限公司，批號20160601)、待檢血清(自配)、3.8%檸檬酸鈉溶液(自配)。

2 方法與步驟

2.1 紅細(xì)胞懸液的配制

2.1.1 1%雞紅細(xì)胞懸液配制 分別從健康成年雞翅靜脈、單只健康成年免疫公雞(翅靜脈、心臟)采集2.5ml抗凝血液，于各自相對應(yīng)離心管中，加入四倍體積的生理鹽水混勻，以2000r/min離心5min，去掉血漿和白細(xì)胞層，重復(fù)以上過程，反復(fù)洗滌3次(第3次離心8min)，吸取0.2ml壓積紅細(xì)胞加入19.8ml生理鹽水混勻，配成相對應(yīng)體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液[2]。

2.1.2 不同濃度雞紅細(xì)胞懸液配制 從健康成年非免疫公雞翅靜脈采集2.5ml抗凝血液，于離心管中，加入四倍體積的生理鹽水混勻，以2000r/min離心5min，去掉血漿和白細(xì)胞層，重復(fù)以上過程，反復(fù)洗滌3次(第3次離心8min)，按0.25%(吸取0.25ml壓積紅細(xì)胞加入99.75ml生理鹽水混勻)、0.5%、0.75%、0.8%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、1.8%、2%，配成相對應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的雞紅細(xì)胞懸液[3]。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 以不同采血方式分組 通過《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)血凝-血凝抑制試驗(yàn)測定同種抗原/血清的血凝-血凝抑制滴度[4]，每組做待檢血清50份。分組見表1。

表1 血凝-血凝抑制試驗(yàn)分組

2.2.2 配制不同濃度雞紅細(xì)胞懸液 通過《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)血凝試驗(yàn)測定同種抗原的血凝滴度：將非免疫公雞紅細(xì)胞懸液配制成0.25%、0.5%、0.75%、0.8%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、1.8%、2%的濃度，做HA試驗(yàn)測定同種抗原的血凝滴度，每組做待檢血清50份。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 HA試驗(yàn)判定抗原血凝價 （1）取96孔V型血凝反應(yīng)板，用微量移液器在1～12孔每孔加0.025ml生理鹽水；（2）吸取0.025ml的待檢抗原加入第1孔中，吹打4次混勻混合液，從第1孔中吸取0.025m L混合液于第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，從第11孔吸取0.025ml混合液棄去，設(shè)第I2孔為生理鹽水對照；（3）每孔各加入0.025ml生理鹽水；（4）每孔各加入0.025ml雞紅細(xì)胞懸液；振蕩混勻混合液，室溫22℃下靜置約40 min，觀察結(jié)果；（5）結(jié)果判斷：在生理鹽水對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞是否完全凝集。以使紅細(xì)胞完全凝集的病毒最大稀釋度為該抗原的血凝滴度，紅細(xì)胞完全凝集的病毒的最高稀釋倍數(shù)為1個血凝單位(HAU)。

2.3.2 HI試驗(yàn)測定被檢血清的抗體效價 （1）取96孔V形微量反應(yīng)板，用移液器在第1孔～第11孔各加入0.025ml生理鹽水，第12孔加入0.05ml生理鹽水。（2）在第1孔加入0.025ml被檢血清，吹打4次混勻混合液，吸取0.025ml混合液于第2孔，依次倍比稀釋到第10孔，從第10孔吸取0.025ml混合液棄去，第11孔為病毒對照，第12孔為生理鹽水對照。并設(shè)新城疫標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照、陽性血清對照。（3）在第1孔～第11孔各加入0.025ml 4HAU抗原，振蕩混勻混合液，室溫下22℃靜置30min。（4）每孔加入0.025ml1%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻混合液，室溫22℃下靜置約40min觀察結(jié)果。（5）結(jié)果判定：在對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞是否呈淚珠狀流下。血凝抑制滴度是指紅細(xì)胞產(chǎn)生完全不凝集(紅細(xì)胞完全流下)的病毒最高稀釋度。（6）本次試驗(yàn)的陰、陽性血清HI滴度應(yīng)與已知滴度相差在1個相對應(yīng)滴度范圍內(nèi)，并且所用陰、陽性血清都不發(fā)生自凝[4]。

3 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用EXCEL軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。（1）根據(jù)試驗(yàn)記錄，公雞和母雞紅細(xì)胞懸液對抗體之間的差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析結(jié)果見表2。

表2 海藍(lán)褐蛋公雞、母雞紅細(xì)胞懸液對抗體指標(biāo)分析 (log)

表2可見，海藍(lán)褐蛋公雞、母雞紅細(xì)胞懸液抗體水平差異極顯著(P＜0.01)，因此海藍(lán)褐單只健康成年雞的性別不同，其配制的1%雞紅細(xì)胞懸液對雞新城疫HA-HI試驗(yàn)的檢測結(jié)果是有區(qū)別的，免疫公雞靜脈1%雞紅細(xì)胞懸液測得HI試驗(yàn)比母雞高，免疫母雞靜脈血相對于同品種免疫公雞對新城疫病毒更敏感，建議在同等條件下優(yōu)先考慮使用母雞血進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)的檢測[7]。（2）根據(jù)試驗(yàn)記錄，對靜脈和動脈抗體之間的差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析結(jié)果見表3。

表3 海藍(lán)褐蛋雞靜脈、動脈紅細(xì)胞懸液對抗體指標(biāo)分析 (log)

表3可見，海藍(lán)褐蛋雞靜脈、動脈紅細(xì)胞懸液對抗體指標(biāo)上，抗體水平差異不顯著(P＞0.05)，建議在緊急大量測待檢樣時可以采用雞心臟采血這種快速采血方式[8]。（3）用健康成年單只籠養(yǎng)與散養(yǎng)免疫公雞1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，測定的抗原血凝效價按《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)標(biāo)準(zhǔn)來判讀是一致的，但是仔細(xì)觀察，新城疫抗原對其兩種紅細(xì)胞的凝集能力還是有區(qū)別的，即散養(yǎng)免疫公雞效價判讀孔中的判讀點(diǎn)要大于籠養(yǎng)公雞。用健康成年單只籠養(yǎng)與散養(yǎng)免疫公雞翅靜脈1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，測定血清的血凝效價按《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2008)標(biāo)準(zhǔn)來判讀，散養(yǎng)雞紅細(xì)胞測得的血凝效價比籠養(yǎng)雞高出一個滴度效價數(shù)為20組(47.6%)，血凝效價相等為22組(52.4%)。綜上說明籠養(yǎng)免疫公雞靜脈血相對于同品種散養(yǎng)免疫公雞對新城疫病毒更敏感，建議在同等條件下優(yōu)先考慮使用籠養(yǎng)免疫公雞血進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)的檢測。（4）用制備的單只健康非免疫成年公雞翅靜脈血的不同濃度紅細(xì)胞懸液，進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)，發(fā)現(xiàn)0.25%雞紅細(xì)胞懸液對血凝試驗(yàn)無結(jié)果，0.5%雞紅細(xì)胞懸液測得血凝試驗(yàn)比0.75%高出1個滴度，比1%高出2個滴度，比1.25%高出2個滴度，比1.5%高出2個滴度。因此，低于0.8%雞紅細(xì)胞懸液對血凝試驗(yàn)是有影響的，1%%～1.5%雞紅細(xì)胞懸液對血凝試驗(yàn)結(jié)果沒有影響，但隨著上述雞紅細(xì)胞懸液濃度增大，其反應(yīng)孔中的反應(yīng)液愈加渾濁，很容易影響判讀結(jié)果。建議在配制紅細(xì)胞懸液時，濃度不要低于1%，但也不能過高，不能超過1.5%。

4 結(jié)論

通過試驗(yàn)表明，母雞紅細(xì)胞懸液相對于同品種公雞對新城疫抗原更敏感；在緊急大量檢測新城疫樣品時，可以采集雞心臟血進(jìn)行快速大量制備HA-HI試驗(yàn)所需的紅細(xì)胞懸液；1%-1.5%濃度范圍的雞紅細(xì)胞懸液對HA試驗(yàn)是有效的，但要注意判讀誤差[5]

[1] 吳玲. 杭州市正常水禽中主要血凝性病毒的檢測[D]. 杭州: 浙江大學(xué) 2006.

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. GB/T16550-2008中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)新城疫診斷技術(shù)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[3] 趙平偉, 費(fèi)強(qiáng). 雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)的質(zhì)量控制[J]. 今日畜牧獸醫(yī). 2014(10).

[4] 王延樹, 張芳. 血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要領(lǐng)[J]. 中國動物保健.2009(8).

[5] 雷莉輝. 影響血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的因素分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī). 2013(6).

S852.4+5

A

1007-1733(2017)10-0004-02

科技創(chuàng)新項(xiàng)目：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)學(xué)院科技創(chuàng)新項(xiàng)目(XY-XF-16-06)。

2017–06–13）