黃曲霉毒素M1酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立*

盧曉霞 謝海軍 宋 崴 趙 邑 何永吉，2***（

1山西省生物研究所，山西太原 030006）（2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原 030006）

黃曲霉毒素M1酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立*

盧曉霞1**謝海軍1宋 崴1趙 邑1何永吉1，2***（

1山西省生物研究所，山西太原 030006）（2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原 030006）

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉（Aspergillus flavus） 和寄生曲霉（A.parasiticu）產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變作用，嚴(yán)重威脅食品安全。黃曲霉毒素具有6種結(jié)構(gòu)極為接近的類型，分別為B1、B2、G1、G2、M1和M2型。其中黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）主要存在于蛋、奶中，是黃曲霉毒素B1的次級(jí)羥基化代謝物，高溫等常規(guī)操作難以將其破壞，具有很大的危害性，是目前食品污染監(jiān)測的重點(diǎn)。

酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測方法具有快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測AFM1的首選方法。目前已建立多種檢測AFM1的ELISA方法，然而仍無法滿足國際上對(duì)AFM1限量標(biāo)準(zhǔn)不斷更新的要求，并存在敏感性差、操作繁瑣、標(biāo)準(zhǔn)化程度低等諸多問題。本研究通過合成AFM1-KLH和AFM1-OVA完全抗原，分別制備了AFM1單克隆抗體和多克隆抗體，并利用單克隆抗體和多克隆抗體建立夾心ELISA定量檢測方法，為深入研究AFM1的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃曲霉毒素M1、B1、B2、G1和G2標(biāo)準(zhǔn)品，弗氏免疫佐劑，抗體亞類鑒定試劑盒，Sigma公司；鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、AP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、PEG1500、鄰苯二胺 （OPD）、NBT/BCIP顯色劑，南京金斯瑞公司；健康雌性Balb/c小鼠及新西蘭大白兔，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。其他常規(guī)試劑全部為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 AFM1半抗原、完全抗原合成

按照參考文獻(xiàn)［3］中的方法，采用琥珀酰亞胺法將AFM1轉(zhuǎn)化成AFM1肟化物（AFM1O）半抗原，然后利用碳化二亞胺法（EDC）與載體蛋白KLH和OVA反應(yīng)，有機(jī)合成完全抗原AFM1-KLH和AFM1-OVA。

1.2.2 AFM1單克隆抗體制備

按照經(jīng)典雜交瘤技術(shù)方法，以AFM1-KLH為免疫抗原，采用標(biāo)準(zhǔn)免疫程序免疫5周齡健康雌性Balb/C小鼠，以AFM1-KLH作為包被抗原，采用間接ELISA法監(jiān)測免疫效果；采用PEG1500化學(xué)法完成免疫后脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合，以 AFM1-OVA為篩選抗原，聯(lián)合間接ELISA方法和有限稀釋法篩選陽性克隆，最后采用擴(kuò)大培養(yǎng)方法生產(chǎn)單克隆抗體。上清經(jīng)ProteinA親和柱層析后收集洗脫液，利用聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）鑒定。

1.2.3 AFM1多抗血清的制備

AFM1-KLH作為免疫抗原，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫程序，分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑充分乳化后，經(jīng)皮下多點(diǎn)免疫。初次免疫量控制在0.8 mg/只，其余3次免疫量均減半，8周后從頸動(dòng)脈采全血。以AFM1-OVA為包被抗原，按照間接ELISA法檢測血清效價(jià)。收獲的抗血清交換至磷酸緩沖液（PBS）后，同樣采用ProteinA親和柱層析分離純化收集洗脫液，利用SDS-PAGE和Western blot鑒定。

1.2.4 雙抗體夾心ELISA方法的建立

制備的AFM1單克隆抗體經(jīng)碳酸鹽包被液包被后，鋪96孔板，100 μL/孔；次日經(jīng)PBST（即PBS緩沖液中加入吐溫-20配制而成）洗滌后加入5%脫脂奶粉封閉液封閉；洗滌后加入AFM1-OVA標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者待測樣品，37℃孵育反應(yīng)1 h；加入AFM1兔多抗，100 μL/孔，37℃孵育反應(yīng)1 h；加入商品化的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，100 μL/孔，37℃孵育反應(yīng)1 h；加入TMB底物顯色液，室溫下避光反應(yīng)，加入30 μL/孔、2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，于450 nm處測定。

1.2.5 ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化

采用方陣滴定法對(duì)包被單克隆抗體濃度、兔多抗?jié)舛?、酶?biāo)二抗稀釋度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以優(yōu)化的 ELISA參數(shù)為試驗(yàn)條件，以AFM1-OVA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，依次測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、8.0 ng/mL、16.0 ng/mL、32.0 ng/mL、64.0 ng/mL、128.0 ng/mL、256.0 ng/mL時(shí)在450 nm處的光密度（OD）值，以AFM1-OVA標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，450 nm處的OD值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測范圍、最低檢測限、批間和批內(nèi)變異系數(shù)，對(duì)所建立的ELISA方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3 結(jié)果

1.3.1 AFM1單克隆抗體的制備及鑒定

采用細(xì)胞融合技術(shù)獲得一株可穩(wěn)定分泌抗AFM1抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)Western blot檢測該抗體可以特異性結(jié)合AFM1抗原，結(jié)果見圖1。抗體亞類鑒定結(jié)果顯示該抗體屬IgG1。經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生抗體后，其效價(jià)可達(dá)1∶5×103。細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng) Protein ng/mL A親和層析純化后，經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)，并經(jīng)親和層析純化后，可獲得較純的AFM1單抗。

1.3.2 AFM1多克隆抗體的制備及鑒定

以AFM1-KLH免疫新西蘭大白兔收獲多抗血清后，經(jīng)Protein A柱分離純化（見圖2），抗體效價(jià)可達(dá)1∶105，由Western blot檢測結(jié)果可知，其同樣具有特異性識(shí)別AFM1抗原的能力，且無其他假陽性結(jié)果出現(xiàn)（見圖1）。

圖1 Western blot檢測單抗和多克隆抗體的特異性

圖2 SDS-PAGE檢測單抗和多抗

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

方陣滴定法確定了ELISA各反應(yīng)最優(yōu)條件，以AFM1-OVA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.004 4x+0.002 1（R2= 0.992 2），其中x為AFM1-OVA標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量濃度、y為OD450值，工作范圍為0.5 ng/mL～128 ng/mL；批內(nèi)、批間差分別為6.21%和5.23%，均小于10%，重復(fù)性良好，最低檢測限為0.5 ng/mL。

圖3 夾心ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

AFM1作為一種目前奶制品最為重要的檢測項(xiàng)目之一，其檢測結(jié)果直接關(guān)系到奶制品的質(zhì)量安全，因此，急需建立一種可以適應(yīng)監(jiān)管一線的方法，從而快速、準(zhǔn)確、簡便地完成對(duì)AFM1的監(jiān)測。利用ELISA方法完成AFM1檢測是目前該領(lǐng)域的主要方向之一。而ELISA檢測的關(guān)鍵是獲得具有特異性的高活性抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。目前關(guān)于AFM1單克隆抗體和多克隆抗體的制備已多有報(bào)道，然而其特異性、敏感性以及穩(wěn)定性均差強(qiáng)人意。建立一種可適用于生產(chǎn)實(shí)際的應(yīng)用性檢測方法，不僅要選擇標(biāo)準(zhǔn)化的檢測抗原建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且要選擇具有高度特異性的抗體來防止假陽性的出現(xiàn)，同時(shí)要經(jīng)過優(yōu)化篩選提高方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，才能真正建立一種具有實(shí)際可操作性的ELISA檢測方法。

本研究制備了完全抗原AFM1-KLH、AFM1-OVA，大大提高了抗原的免疫原性，通過雙抗原結(jié)合制備了高特異性的單克隆抗體，降低了與其他黃曲霉毒素種類的交叉反應(yīng)性；通過免疫新西蘭大白兔，制備了與單克隆抗體不同種屬的多克隆抗體；最終通過ELISA方陣滴定法優(yōu)化試驗(yàn)條件，建立了敏感、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的單抗-多抗夾心ELISA方法，為替代國外進(jìn)口試劑，研發(fā)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的AFM1檢測試劑奠定基礎(chǔ)。

［1］YOSHIZAWA T，YAMASHITA A，LUO Y.Fumonisin occurrence in cornfrom high and low risk areas for human esophageal cancerin China［J］.Appl Environ Microbiol，1994，60（5）:1 626-1 629.

［2］裴世春，鄭麗娜，唐彥君，等.黃曲霉毒素M1檢測ELISA條件的優(yōu)化及應(yīng)用研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20（5）:57-60.

［3］王勇.黃曲霉毒素M1單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性研究［J］.大眾標(biāo)準(zhǔn)化，2016（4）:61-63.

Development of enzyme-linked immunosorbent assay for AFM1detection*

LU Xiaoxia1**XIE Haijun1SONG Wei1ZHAO Yi1HE Yongji1，2***1（Biology institute of Shanxi，Shanxi Taiyuan 030006，China）
2（Institute of agricultural products processing，Shanxi academy of agricultural sciences，Shanxi Taiyuan 030006，China）

建立單抗-多抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測方法，為黃曲霉毒素M1（AFM1）的快速檢測及研究奠定基礎(chǔ)。采用有機(jī)合成法將AFM1轉(zhuǎn)化成半抗原AFM1肟化物（AFM1O），進(jìn)一步與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成完全抗原AFM1-KLH和AFM1-OVA；以AFM1-KLH為免疫抗原、AFM1-OVA為篩選抗原，采用雜交瘤技術(shù)制備AFM1單克隆抗體，以AFM1-KLH免疫新西蘭大白兔制備兔多克隆抗體；以AFM1-OVA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制備的單克隆抗體為捕獲抗體，純化的兔多克隆抗體為檢測抗體，商品化HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為檢測二抗，采用方陣滴定法優(yōu)化各步檢測條件，得到最佳試驗(yàn)條件，建立AFM1夾心ELISA檢測方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.004 4x+0.002 1(R2=0.992 2)，檢測范圍0.5 ng/mL～128 ng/mL；最低檢測限為0.5 ng/mL，批內(nèi)和批間差均小于10%，重復(fù)性良好。

AFM1；抗體；ELISA

Objective development of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for detection of AFM1.Methods the hapten AFM1O was synthesized from derivatives of AFM1by a chemical process.Further,complete antigen AFM1-KLH and AFM1-OVA were synthesized by couple AFM1with KLH and OVA respectively.AFM1-KLH and AFM1-OVA were subsequently used as immunogen and detecting antigen to screen mAb produced by hybridoma cells agains and pcAb produced from antiserum.Then a sandwich ELISA for determination of AFM1was developed using the AFM1-OVA as standard protein,in which the monoclonal and ployclonal antibody previously produced were chosen as a capture antibody and detect antibody,respectively.The results showed the standard linear equation,y=0.004 4x+0.002 1（R2=0.992 2）,was established for the determination of AFM1concentration with the valid rang of 0.5～128ng/mL.The susceptibility of the ELISA was about 0.5 ng/mL of AFM1concentration.

AFM1；antibody；ELISA

TS207

A

1673-6044（2017）02-0058-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.02.016

山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（201601D102041）。

**盧曉霞，女，1984年出生，2004年畢業(yè)于山西大學(xué)生物工程專業(yè)，助理研究員。

***何永吉，通訊作者，E-mail：heyongji_919@163.com.

2017-03-03