副溶血性弧菌的耐藥性及多位點序列分型*

劉書亞 孫成春 王明義 李永芬

(1.泰山醫(yī)學院藥學院，山東 泰安 271016；2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東 濟南 250031；3.威海市立醫(yī)院檢驗科，山東 威海 264200)

副溶血性弧菌的耐藥性及多位點序列分型*

劉書亞1孫成春2王明義3李永芬1

(1.泰山醫(yī)學院藥學院，山東 泰安 271016；2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東 濟南 250031；3.威海市立醫(yī)院檢驗科，山東 威海 264200)

目的 了解近年來我國東部沿海地區(qū)某醫(yī)院及周邊海域的副溶血性弧菌分離株的耐藥狀況及多位點序列分型。方法 對2012—2015年分離培養(yǎng)的40株副溶血性弧菌進行藥敏試驗；選取副溶血性弧菌的7對管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC和tnaA作為靶標基因，對分離培養(yǎng)的40株副溶血性弧菌樣本進行PCR擴增、測序及序列分析。結果 菌株對氨芐西林的耐藥率為100%，對頭孢唑啉的中介率為37.5%，對頭孢他啶、亞胺培南、左氧氟沙星等15種抗菌藥則完全敏感。40株副溶血性弧菌有22個ST型，檢測出17個新的ST型。結論 多位點序列分型和藥敏結果對研究副溶血性弧菌進化關系、食源性疾病的防控和臨床合理用藥提供了技術支持和數(shù)據(jù)參考。

副溶血性弧菌；耐藥性；進化關系；多位點序列分型

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,VP)，是我國沿海城市常見的食源性致病菌。近年來，食物中毒事件時有發(fā)生，并且發(fā)病規(guī)模逐年擴大，其中微生物性食物中毒事件中由副溶血性弧菌引起的占到第一位[1]。為了解我國東部沿海地區(qū)某醫(yī)院及周邊海域的副溶血性弧菌分離株耐藥狀況及多位點序列分型，檢測了2012—2015年分離的40株副溶血性弧菌的耐藥性并采取了多位點序列分型方法對菌株進行基因分型，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1菌株

21株副溶血性弧菌臨床株來自我國東部沿海地區(qū)某醫(yī)院食物中毒患者的肛拭子，19株環(huán)境分離株來自周圍水域。藥敏質控菌株ATCC25922由國家藥品生物制品檢定所提供。

1.2儀器與試劑

法國梅里埃VITEK-2 Compact自動細菌鑒定儀、法國梅里埃Vitek細菌比濁儀、Thermo Scientific高速冷凍離心機、ABI 9700普通PCR儀、南京新校園生物技術研究所的電泳儀(瓊脂糖)、Bio-Rad凝膠成像及分析系統(tǒng)、青島高科園海博生物技術有限公司的TCBS瓊脂，DL2000 DNA Marker、Premix Taq和Gold-ViewⅡ型核酸染色劑等購自大連寶生物公司，NaCl等其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均在有效期內使用。

1.3方法

1.3.1陽性分離株的鑒定 所有副溶血性弧菌菌株經(jīng)法國梅里埃全自動微生物分析系統(tǒng)和API生化鑒定系統(tǒng)檢測，結果符合者判定為實驗用菌株。

1.3.2藥敏試驗 根據(jù)美國臨床實驗標準委員會NCCLS (2012年版)推薦的腸桿菌科抗菌藥分組，采用VITEK-2 Compact AST-GN08進行藥敏檢測。取0.45%無菌鹽水約3.5 ml，接種菌落→混勻→麥氏計比濁儀測濁度(約為0.5～0.6麥氏單位)，將調配好的菌液的試管置于專用卡架上，并插入相應的藥敏卡，放入儀器中按照說明書進行上機操作。

1.3.3引物設計與合成 根據(jù)國際多位點序列分型數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)上已公布的7對引物recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC和tnaA序列，由英濰捷基(上海)貿易有限公司進行合成。引物序列詳見表1。將各引物稀釋至10μmol/L，于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列及目的片段長度

1.3.4DNA的提取 采用煮沸法提取目的基因。在Eppendorf管中加入200μl無菌水，然后將過夜培養(yǎng)的菌株用接種環(huán)挑入管中，12000 r/min離心5min，于100 ℃水中煮10 min后，-20 ℃冰箱中放置5 min，12000 r/min離心5 min，棄去沉淀，吸取上清液分裝于Eppendorf管中并儲存在-20 ℃冰箱中以備用。

1.3.5PCR反應及基因測序 PCR反應體系共25μl，模板1μl，上下游引物各1μl，12.5μLPremix Taq，9.5μl無菌水。擴增條件：96 ℃預變性10 min；96 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。在100 V電壓下，用1%的瓊脂糖凝膠將擴增產物電泳35 min左右后，采用凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶。分析正確后將擴增產物送至英濰捷基(上海)貿易有限公司進行雙向測序。

1.3.6多位點序列分型 登錄國際多位點序列分型數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/ vparahaemolyticus/)，將本試驗獲得的40株副溶血性弧菌的7個管家基因測序結果與數(shù)據(jù)庫已知信息進行比對，以獲取菌株的等位基因編號。將已得菌株的7個基因的編號與數(shù)據(jù)庫已知信息進行比對，獲取菌株的序列型(sequence type,ST)。在兩次MLST實驗后，應向該網(wǎng)站提交沒有等位基因序號的菌株的背景資料，申請新的ST型號，該步驟由本實驗室人員共同完成。

1.3.7構建系統(tǒng)進化樹 將40株副溶血性弧菌7個等位基因的核苷酸序列剪切，使菌株的DNA雙鏈以dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC and tnaA的順序和相同的方向排列，采用MEGA6.06軟件中的Neighbor-joining法將其構建系統(tǒng)進化樹，比較親緣關系。

2 結 果

2.1藥敏結果

40株副溶血性弧菌存在1種耐藥譜，對氨芐西林耐藥(40株，耐藥率100%)，對頭孢唑啉中介(15株，中介率為37.5%)，對頭孢他啶、亞胺培南和左氧氟沙星等抗菌藥均敏感，未檢測出多重耐藥菌株，其藥敏試驗結果見表2。

表2 副溶血性弧菌藥敏試驗結果

2.2多位點序列分型結果

40株副溶血性弧菌共22個ST型(表3)，優(yōu)勢序列型為ST3，占25%(10/40)，其他主要序列型有ST332，占20%(8/40)；ST1533，占5%(2/40)；ST1545，占5%(2/40)。其中17株為首次發(fā)現(xiàn)的ST型，新的ST型號分別為ST1533、ST1534、ST1535、ST1536、ST1537、ST1538、ST1539、ST1540、ST1541、ST1542、ST1543、ST1545、ST1546、ST1547、ST1548、ST1549和ST1550。

表3 多位點序列分型結果

注：VP1-VP21編號為臨床株，VP22-VP40為環(huán)境株。斜體加粗的ST型號為首次發(fā)現(xiàn)的。

2.3構建進化樹

利用MEGA6.06軟件中的Neighbor-joining法構建進化樹(圖1)，分析遺傳關系。進化樹將40株副溶血性弧菌分成兩個群，VP11為一個群，其他39株屬于另外一個群。環(huán)境株VP28和臨床株VP17在進化樹上不是同一序列型，它們卻表現(xiàn)出100%的遺傳關系。VP22和VP24，VP23和VP26在進化樹上也表現(xiàn)出高度的親緣性(100%)。

圖1 副溶血性弧菌MLST進化樹

3 討 論

3.1耐藥現(xiàn)狀

40株VP的耐藥結果基本一致：均對氨芐西林 耐藥，部分對頭孢唑啉中度敏感，對頭孢他啶、亞胺培南和左氧氟沙星等其余15種抗菌藥完全敏感，沒有出現(xiàn)多重耐藥菌株。說明目前臨床上大部分使用的抗菌藥都是可行的。這與國內外其他地區(qū)的副溶血性弧菌耐藥情況略有差別，如宋曼丹等[2]的研究結果顯示廣州地區(qū)的副溶血性弧菌對阿米卡星的耐藥率達到65.9%，且對2 種以上抗菌藥耐藥的有93.2%，同時對5種以上抗菌藥耐藥的有45.5%。李雪等[3]人報道38株臨床菌中部分菌株對8種抗生素中的萘啶酸、頭孢噻虧、頭孢西丁產生了不同程度的耐藥。Yu Q等[4]人報道71株副溶血性弧菌都耐氨芐青霉素和萬古霉素，對頭孢菌素、利福平、鏈霉素的耐藥率為52.2%、50.7%和50.7%。從上述研究結果可知，不同地區(qū)的臨床菌株和環(huán)境菌株耐藥性有所不同，這除了受到菌株種類的影響，而且還受到該地區(qū)用藥方法和劑量的影響[5]。

分析本研究結果，其原因可能是氨芐西林價格較便宜、使用時間長以及用藥范圍廣，導致水產品和周圍環(huán)境菌株出現(xiàn)耐藥性，其耐藥菌通過食物鏈進入人體，可引發(fā)急性胃腸炎甚至原發(fā)性敗血癥，對人體健康造成嚴重危害。另一方面由于臨床上及水產養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥的不規(guī)范使用，導致產生一些耐藥菌，通過生物鏈傳播到環(huán)境中。如此惡性循環(huán)，將會導致副溶血性弧菌耐藥性日益嚴重，但對其耐藥性的研究與畜禽源病原菌如大腸桿菌和沙門氏菌等相比還有很大的差距。目前，國內外都沒有將副溶血性弧菌耐藥性納入監(jiān)測系統(tǒng)，缺乏耐藥性流行病學監(jiān)測數(shù)據(jù)。此外，副溶血性弧菌耐藥質粒的消除及轉移機制、整合子的分布及結構、耐藥基因的分布及傳播擴散機制等仍存在研究空白[6]。因此對副溶血性弧菌引起的食物中毒更應該進行深入細致的研究。

3.2多位點序列分型

與分子流行病學相比，傳統(tǒng)流行病學在分析傳染源，確定傳染途徑等方面具有靈敏度低和精確度不夠高的缺點。分子生物學研究的深入與進步，豐富了食源性病原菌的分子分型方法，其中MLST法具有分辨率高、可重復性強的特點，因而被廣泛應用和普遍接受[7]。MLST已用于副溶血性弧菌、空腸彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌等多種微生物的研究[8-10]。

本研究結果表明，40株副溶血性弧菌共分為22個ST型，ST3為優(yōu)勢ST型，其次為ST332。經(jīng)查閱文獻可知ST3為全球流行的ST型，而次流行ST332型與國內外報道略有差異。如Han C等[11]人報道 ST3引起了廣泛的感染多達16個國家。Chen Y[12]等人的研究顯示中國南部的主要優(yōu)勢ST型為ST3和ST88。Lüdeke CH等[13]人報道的58株副溶血性弧菌中臨床優(yōu)勢ST型為ST36，其次為ST3。由進化樹可知，40株菌被分成兩大群，僅1個臨床分離株VP11為一群，且它是新發(fā)現(xiàn)的ST型，說明可能是由于VP11的基因發(fā)生了點突變。本研究發(fā)現(xiàn)了17個新的ST型，大部分是環(huán)境分離株，且不同地區(qū)的副溶血性弧菌的基因分型是不同的，說明我國東部沿海地區(qū)的MLST的研究存在嚴重不足。由圖1可知環(huán)境分離株VP28和臨床分離株VP17的親緣關系為100%，證實了致病菌株在臨床和環(huán)境中之間的傳播。因此副溶血性弧菌耐藥性和MLST研究，能夠為臨床診斷、醫(yī)院感染監(jiān)控、流行病學調查、食物中毒暴發(fā)時的追蹤溯源，預防控制疾病的散播以及合理使用抗菌藥物提供理論依據(jù)和技術支持。

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Antimicrobial resistance and multilocus sequencing typing of Vibrio parahemolyticus

LIU Shu-ya1SUN Cheng-chun2WANG Ming-yi3LI Yong-fen1

(1.School of Pharmacy, Taishan Medical University, Taian 271016, China;2.Dept.of Pharmacy,General Hospital of Jinan Military Area，Jinan 250031,China;3. Dept.of Clinical Laboratory, Weihai Municipal Hospital,Weihai 264200,China)

Objective:To study the current status of multilocus sequencing typing (MLST) and drug resistance in Vibrio parahaemolyticus (VP) isolates from a hospital in the eastern coastal area of China and the surrounding waters. Methods：40 VP isolated from 2012 to 2015 were studied by the drug sensitive test;7 house-keeping genes of VP (dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC and tnaA) were selected as the target genes, and the products of 40 VP isolated were amplified, sequenced and analyzed. Results：22 sequences types (ST) were identified among the 40 VP strains by using MLST analysis, 17 new types were found. The resistant rate of the VP strains to ampicillin was 100%, and the mediation rate of the VP strains to cefazolin was 37.5%, but no resistance to other 15 antibiotics, including ceftazidime, imipenem and levofloxacin were detected. Conclusion：MLST and drug susceptibility results would provide scientific support and data reference for the study on evolution, prevention and control of foodborne diseases and clinical rational drug use.

vibrio parahaemolyticus;antimicrobial resistance;evolutionary relationships;multilocus sequencing typing

山東省重點研發(fā)計劃(2016GSF121036)。

劉書亞(1988—)，女，碩士，研究方向：臨床藥學。

孫成春(1965—)，女，主任藥師，碩士生導師。E-mail:yaolike295@126.com；王明義(1973—)，男，主任技師，碩士生導師。E-mail:wangmingyi1973@outlook.com。

R969

A

1004-7115(2017)10-1084-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.002

2017-07-21)