不同病期慢性阻塞性肺疾病趨化因子受體3和淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)及其影響

張志亮，李斯南，陳 昊，羅 濤，陳玉玲

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221002)

不同病期慢性阻塞性肺疾病趨化因子受體3和淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)及其影響

張志亮，李斯南，陳 昊，羅 濤，陳玉玲

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221002)

目的 觀察急性加重期、穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血中的趨化因子受體3(CXCR3)及淋巴細(xì)胞亞群水平，并闡明其對(duì)COPD的影響。方法 選取徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科2015年1月至2016年6月先后收治的急性加重期、穩(wěn)定期COPD患者以及健康體檢人員各43例，將其分為急性加重期組、穩(wěn)定期組及健康對(duì)照組；檢測(cè)血中T細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞及CXCR3的表達(dá)水平，并進(jìn)行分析比較。結(jié)果 與健康對(duì)照組比較，各病期的COPD患者血中T細(xì)胞亞群的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+以及B淋巴細(xì)胞水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)，急性加重期組和穩(wěn)定期組的血中T細(xì)胞亞群的趨化因子受體3(CXCR3)在CD4+、CD8+表面的表達(dá)均明顯增高，且急性加重期組也高于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 急性加重期的COPD患者機(jī)體的細(xì)胞免疫系統(tǒng)和體液系統(tǒng)功能失衡，淋巴細(xì)胞亞群與其趨化因子受體3對(duì)急性加重期的COPD患者的病情發(fā)生和發(fā)展可能具有重要影響。

淋巴細(xì)胞亞群；趨化因子受體3；慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)中一種慢性進(jìn)展性疾病，并以肺部不可逆的氣流受限和持續(xù)的炎癥性反應(yīng)為特征[1]。近年來(lái)，人們一直對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了許多研究。目前關(guān)于淋巴細(xì)胞對(duì)COPD影響的研究相對(duì)較少。資料表明，淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞是COPD發(fā)病中重要的炎癥細(xì)胞，其表面存在的趨化因子(chemokine)發(fā)揮了重要作用，其中CXC型趨化因子受體3(CXCR3)是與趨化因子結(jié)合的重要受體之一，廣泛地存在于T淋巴細(xì)胞的表面，與淋巴細(xì)胞向炎癥部位遷移密切相關(guān)[2]，但也還有爭(zhēng)議。本研究旨在觀察不同病期的COPD，各淋巴細(xì)胞表面CXCR3及其亞群的表達(dá)水平，以闡明其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科呼吸內(nèi)科2015年1月至2016年6月收治的43例急性加重期COPD患者、43例穩(wěn)定期COPD患者以及43例健康體檢人員，將其分為急性加重期組、穩(wěn)定期組及健康對(duì)照組。其中急性加重期組女性18例，男性25例，年齡45～89歲，平均(65.2±4.3)歲；穩(wěn)定期組女性19例，男性24例，年齡49～85歲，平均(69.3±6.5)歲；健康對(duì)照組女性21例，男性22例，年齡52～87歲，平均(67.4±3.9)歲，三組受試者的性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) COPD患者的診斷按照2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[3]。對(duì)COPD加重期的患者排除急性心肌梗死、哮喘急性發(fā)作、糖尿病、免疫系統(tǒng)及惡性腫瘤等疾??；COPD穩(wěn)定期的患者是在加重期后有效地抗感染、止咳祛痰、氣道通暢、病情穩(wěn)定一周后者；健康對(duì)照組為我院體檢中心同期、無(wú)吸煙史、無(wú)心肺等疾病的健康體檢者。

1.3 儀器與試劑 采用美國(guó)Beckman流式細(xì)胞儀及其隨同原裝試劑。

1.4 方法

1.4.1 檢測(cè)的指標(biāo) 對(duì)急性加重期組、穩(wěn)定期組患者以及健康對(duì)照組靜脈血中CXCR3、T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+，CD4+，CD4+/CD8+)及 B淋巴細(xì)胞表達(dá)的百分比。

1.4.2 受試者的靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)的提取和分離 COPD急性加重期患者于入院后次日的清晨空腹抽取4 mL靜脈血置于抗凝管，用等體積的PBS緩沖液混勻后最后加入淋巴細(xì)胞分離液，以密度梯度離心法分離出單個(gè)核淋巴細(xì)胞；COPD穩(wěn)定期患者于治療后穩(wěn)定一周時(shí)抽血檢查，健康對(duì)照組者體檢時(shí)抽血檢查。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群及B細(xì)胞的表達(dá)[4-5]將已制備的PBMNC懸液100 μL分別加入流式細(xì)胞儀專(zhuān)用試管甲、乙兩管內(nèi)。然后在甲管中加入PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的抗CD4+抗體和FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的抗CD8+抗體、PerCP(多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物)標(biāo)記的抗CD3+抗體、APC標(biāo)記的抗CD19+抗體(B淋巴細(xì)胞特異性標(biāo)記物)各5 μL；乙管中加入同型相應(yīng)對(duì)照液。經(jīng)混勻、室溫避光30 min，固定洗滌后上機(jī)檢測(cè)各細(xì)胞亞群比例。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群表面CXCR3的表達(dá) 取已制備的PBMNC懸液100 μL分別加入流式細(xì)胞儀專(zhuān)用試管甲、乙兩管內(nèi)。然后在甲管中加入PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的抗CD4+抗體和FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的抗CD8+抗體、PE-Cy5標(biāo)記的抗CXCR3抗體各5 μL；乙管中加入同型相應(yīng)對(duì)照液。經(jīng)混勻、室溫避光30 min，固定洗滌后上機(jī)檢測(cè)并分析計(jì)算CXCR3表達(dá)的百分比[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受試者淋巴細(xì)胞各亞群表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較，穩(wěn)定期組、急性加重期COPD組的血中 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B細(xì)胞水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 三組受試者CD4+CXCR3、CD8+CXCR3表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較，穩(wěn)定期組、急性加重期組的外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面的CXCR3表達(dá)水平均明顯增高，且急性加重期組高于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 三組受試者淋巴細(xì)胞各亞群表達(dá)水平比較s，%)

表1 三組受試者淋巴細(xì)胞各亞群表達(dá)水平比較s，%)

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05。

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表2 三組受試者CD4+CXCR3、CD8+CXCR3表達(dá)水平比較(，%)

表2 三組受試者CD4+CXCR3、CD8+CXCR3表達(dá)水平比較(，%)

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05；與穩(wěn)定期組比較，bP＜0.05。

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3 討論

COPD是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭，具有較高的致殘率和病死率，已成為國(guó)內(nèi)導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[7-8]，對(duì)COPD發(fā)病機(jī)制的研究始終是這一領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但尚未完全闡明，COPD急性發(fā)作的最主要原因是由有害氣體或顆粒進(jìn)入呼吸道誘發(fā)急性炎癥所致[9]。多數(shù)認(rèn)為COPD主要與自由基、炎性細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)的參與有關(guān)，肺泡巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在COPD患者肺組織中浸潤(rùn)，并且與氣流受限的程度呈正相關(guān)[10-11]。故筆者認(rèn)為：深入研究COPD的發(fā)病機(jī)制是尋找其有效防治和改善預(yù)后的關(guān)鍵。

眾所周知，淋巴細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中最重要的部分，它們參與人體細(xì)胞免疫和體液免疫，不僅具有識(shí)別和排斥抗原的作用，而且對(duì)人體的免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)能力，它們能夠防御病毒和細(xì)菌的感染。此外，在呼吸道及全身炎癥損傷中，T淋巴細(xì)胞亞群的免疫功能出現(xiàn)了異常，故被認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)內(nèi)最重要的細(xì)胞群之一；B淋巴細(xì)胞主要參與機(jī)體的體液免疫，其數(shù)量的減少可反映體液免疫功能的低下。COPD的老年患者，由于其免疫功能下降，甚至出現(xiàn)明顯的免疫功能異常[12]。

本研究顯示，在急性加重期及穩(wěn)定期的COPD患者血中T淋巴細(xì)胞各亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及B淋巴細(xì)胞的百分率與健康對(duì)照組比較明顯降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，尤其在急性加重期更為顯著，在穩(wěn)定期患者也尚未完全達(dá)到健康對(duì)照組水平，表明COPD患者在不同的病期均存在著持續(xù)的免疫功能的失衡，故此類(lèi)患者很容易出現(xiàn)呼吸道反復(fù)感染。CD4+能輔助IgG、IgA、IgM合成，CD4+細(xì)胞減少導(dǎo)致產(chǎn)生淋巴因子協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和輔助其他淋巴細(xì)胞的功能減弱。CD8+能抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[13-14]。T淋巴細(xì)胞各亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+下降可導(dǎo)致單核吞噬細(xì)胞活性降低，同時(shí)還可引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞分泌抗體減少而易致反復(fù)的呼吸道感染，使病程遷延。我們的研究，進(jìn)一步證明了淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)性在COPD發(fā)病機(jī)制中確實(shí)占有重要地位。

近來(lái)的研究顯示，趨化因子受體3(CXCR3)在由炎癥細(xì)胞等釋放后，主要在活化的T淋巴細(xì)胞等表面表達(dá)，在局部炎癥、移植排異反應(yīng)等發(fā)揮重要作用[15]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，急性加重期組和穩(wěn)定期組的COPD患者血中 CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面的CXCR3表達(dá)百分率與對(duì)照組比較，均明顯增高(P＜0.05)，并且急性加重期組也高于穩(wěn)定期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。故而筆者推測(cè)：在急性加重期組和穩(wěn)定期的COPD患者，炎癥細(xì)胞等釋放的CXCR3增多，在活化的T淋巴細(xì)胞等表面表達(dá)增加，可能與多種趨化因子迅速結(jié)合，導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞聚集到炎癥部位，致使肺部炎癥反復(fù)發(fā)作。由此可見(jiàn)，CXCR3是COPD病情發(fā)生和發(fā)展的相當(dāng)重要的炎癥介質(zhì)，參與了肺部炎癥的形成和加重。本研究的重要意義在于為如何抑制CXCR3配體的生成、阻斷CXCR3與其配體的結(jié)合及其結(jié)合后的活化過(guò)程，以減輕肺部的炎癥反應(yīng)，提供了新的思考，這也是我們要共同面對(duì)的待解課題。

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Expression and effect of CXCR3 and lymphocyte subsets at different stages in patients with chronic obstructive

pulmonary diseases.ZHANG Zhi-liang,LI Si-nan,CHEN Hao,LUO Tao,CHEN Yu-ling.Department of Respiratory,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,CHINA

Objective To observe the changes in the expression chemokine receptor 3(CXCR3)and lymphocyte subsets in patients with acute exacerbation and stable chronic obstructive pulmonary disease(COPD)and to elucidate their effect on COPD.Methods During January 2015 to June 2016,43 cases of acute exacerbating of COPD patients,43 stable COPD patients,and 43 healthy people in our hospital were selected as the research objects.The expression levels of T lymphocyte subsets,B lymphocytes and CXCR3 in blood were measured and analyzed.Results Compared with the control group,The levels of CD3+,CD4+,CD4+/CD8+of the T lymphocyte subsets and B lymphocyte subsets were significantly decreased in different COPD patients(P＜0.05);while the expression levels of CXCR3 on the surfaces of CD4+and CD8+of the T lymphocyte subsets in peripheral blood of different COPD patients were increased significantly,and those of the acute exacerbating of COPD patients were significantly higher than the stable COPD patients(P＜0.05).Conclusion The functions of the cellular immunity system and the humoral immunity system were dysbalanced apparently in patients with COPD acute exacerbating period.Lymphocyte subsets and their CXCR3 may have a significant effect on the onset and development of COPD patients with acute exacerbations.

Lymphocyte subset;CXC chemokine receptor 3(CXCR3);Chronic obstructive pulmonary disease

R563

A

1003—6350（2017）19—3208—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.037

江蘇省徐州市科技局社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：KC14SH092)

張志亮。E-mail：zzl_xz@msn.cn

2017-01-07)