杜仲葉乙醇提取物的降糖作用機(jī)理

張紅霞，楊丹丹，王 鳳，李伊嬌，范俊峰

杜仲葉乙醇提取物的降糖作用機(jī)理

張紅霞，楊丹丹，王 鳳，李伊嬌，范俊峰*

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

為了闡明杜仲葉的降血糖功效及其機(jī)制，采用酶-抑制劑模型，篩選高抑制率的杜仲葉乙醇提取物并判斷其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型；借助Caco-2人結(jié)腸腺癌細(xì)胞模型，研究杜仲葉20%乙醇解吸物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析杜仲葉20%乙醇解吸物主要成分。杜仲葉20%乙醇解吸物可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制α-葡萄糖苷酶，其抑制常數(shù)Ki值為32.90 mg/mL。它對(duì)Caco-2細(xì)胞中的α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制作用，其IC50為0.57 mg/mL，且對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取葡萄糖也有一定抑制作用，1 mg/mL時(shí)抑制率可達(dá)26.25%。氣相色譜-質(zhì)譜分析表明杜仲葉20%乙醇解吸物主要有DL-異檸檬酸內(nèi)酯、百里酚、兒茶素、2,6-二羥基-苯甲酸和3,4-二羥基-苯丙烯酸等。這些結(jié)果表明，杜仲葉乙醇提取物可以通過抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低葡萄糖吸收來(lái)實(shí)現(xiàn)降血糖的效果。

杜仲葉；Caco-2細(xì)胞；α-葡萄糖苷酶；降血糖；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)；兒茶素

糖尿病已被列為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大致死性疾病[1]。碳水化合物在人體內(nèi)必須經(jīng)由α-葡萄糖苷酶水解其α-1,4糖苷鍵，生成葡萄糖、果糖、半乳糖后才能被小腸吸收。因此通過抑制α-葡萄糖苷酶活性，可延遲或阻礙多糖在消化道內(nèi)水解，以降低人體血糖濃度，可有效防治糖尿病[2-3]。α-葡萄糖苷酶抑制劑，已第3次被亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的一線藥物。α-葡萄糖苷酶抑制劑越來(lái)越成為近年來(lái)藥物化學(xué)的研究熱點(diǎn)[4]。

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是藥理性質(zhì)很強(qiáng)的中藥材，杜仲有降血壓、提高免疫力、抗衰老、補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨等作用[5-6]。同時(shí)，杜仲也是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同用的保健食品，以杜仲鮮葉為原料炮制而成的杜仲茶可減少體內(nèi)多余脂肪和膽固醇[7]，在東亞非常流行。杜仲制成的杜仲晶、杜仲粉等都有一定的保健功效[8-9]。最近研究表明杜仲葉具有降血糖作用[7]，杜仲分離得到的黃酮醇糖苷可抑制糖化作用，作用可以與氨基呱相媲美[10]；杜仲葉水提物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠有一定的降血糖作用[11]；杜仲茶甲醇抽提物可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，維持體內(nèi)適當(dāng)?shù)难侵礫12]。但是，目前對(duì)杜仲葉降血糖的研究大多停留在化學(xué)成分分析、降糖效果上，針對(duì)其在人體內(nèi)降血糖機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)借助Caco-2人結(jié)腸腺癌細(xì)胞模擬人體小腸壁環(huán)境，從腸道二糖酶系活性以及葡萄糖吸收的角度出發(fā)，研究了杜仲葉20%乙醇解吸物降血糖機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)杜仲葉乙醇提取物（ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves，EE）進(jìn)行分離純化，并以酶-抑制劑為模型通過酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，判斷杜仲葉20%乙醇解吸物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型及親和度；然后借助Caco-2細(xì)胞模型，研究了杜仲葉20%乙醇解吸物的降糖作用，并初步探討其作用機(jī)制；最后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)杜仲葉20%乙醇解吸物主要降糖成分進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)可以從糖的消化轉(zhuǎn)運(yùn)途徑闡明杜仲葉降血糖保健功效的原理，為進(jìn)一步生產(chǎn)杜仲葉降血糖保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉采集自陜西漢中略陽(yáng)縣。

大孔樹脂（A B-8） 天津市南開大學(xué)化工廠；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、噻唑藍(lán)（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國(guó)Sigma公司；Caco-2細(xì)胞 北京協(xié)和醫(yī)院；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、胰蛋白酶 美國(guó)HyClone公司；阿卡波糖 拜耳醫(yī)藥保健有限公司；麥芽糖（分析純） 北京化工廠；葡萄糖試劑盒 上海超研試劑有限公司；N,O-雙（ 三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）、三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）上海安普儀器試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LL-1500真空冷凍干燥機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；GC/MS-QP2010A氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本Yamato公司；超凈工作臺(tái) 蘇州醫(yī)療器械儀器廠；ST-360酶標(biāo)儀 上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；倒置顯微鏡 日本Olympuse公司。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉乙醇提取物的提取及純化

杜仲葉洗凈烘干粉碎，過20 目篩，40%乙醇溶液為提取液，料液比1∶60（m/V），浸泡2.5 h后，每次超聲提取1 h，重復(fù)提取2 次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，備用[13]。

將所得樣品配制為質(zhì)量濃度5 mg/mL，共100 mL的EE溶液。使用AB-8大孔樹脂裝入2.0 cm×40 cm玻璃色譜柱，柱床體積60 mL進(jìn)行分離純化。首先，吸附過程中調(diào)節(jié)流速為1.0 mL/min，直到提取液完全進(jìn)入樹脂層；充分吸附后依次使用200 mL的0、20%、40%、60%、80%乙醇溶液以2.0 mL/min流速進(jìn)行洗脫，收集解吸液，分別為EEA、EEB、EEC、EED、EEE，濃縮后冷凍干燥，備用[14]。具體的提取分離流程如圖1所示。

圖1 杜仲葉活性成分提取分離流程Fig.1 Extraction and separation of bioactive components from Eucommia ulmoides leaves

1.3.2 杜仲葉乙醇提取物對(duì)酶-抑制劑模型的α-葡萄糖苷酶的抑制作用

在96 孔酶標(biāo)板上，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)孔中先后加入120 μL 0.5 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.7），20 μL一定質(zhì)量濃度的杜仲葉乙醇提取物，50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（25 mg/mL）和50 μL PNPG（3 mmol/L），混勻后37 ℃反應(yīng)1 h，然后加入50 μL碳酸鈉溶液（0.67 mol/L）終止反應(yīng)，最后在405 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度[15]。按公式（1）計(jì)算酶活性抑制率。

式中：A1為空白組吸光度，20 μL的去離子水代替提取液；A2為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A3為背景組吸光度，只加入提取物，以100 μL磷酸緩沖液代替α-葡萄糖苷酶及PNPG。

1.3.3 EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

選定質(zhì)量濃度為10、20 mg/mL的EEB，分別加入濃度（[S]）為1、3、6、9、12 mmol/L的PNPG，按照1.3.2節(jié)方法作出不同濃度的PNPG吸光度A隨時(shí)間t變化圖，并以直線部分求速率V，同時(shí)測(cè)定不加抑制劑時(shí)不同濃度PNPG的反應(yīng)速率[16]。按Lineweaver-Burk 作圖，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，分別繪制不同濃度EEB的抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線，求出米氏常數(shù)Km并根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程（2），確定抑制常數(shù)Ki值。

1.3.4 EEB的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法，選擇EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度。將細(xì)胞懸液稀釋為3×104個(gè)/mL，混勻后每孔100 μL接種于96 孔板上，37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育24 h，棄上清液，貼壁細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，每孔加入含EEB的完全培養(yǎng)基（對(duì)照孔只加完全培養(yǎng)基）100 μL，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。加MTT（5 mg/mL）每孔20 μL，置37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育5 h，棄上清液，加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）每孔200 μL，避光振蕩15 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[17]。

1.3.5 EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型α-葡萄糖苷酶活性的抑制

實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，Caco-2細(xì)胞接種于24 孔板上（4×104個(gè)/mL），培養(yǎng)至12 d。實(shí)驗(yàn)前棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS洗3 次，除去細(xì)胞表面附著物。空白組每孔加入l mL PBS；陰性對(duì)照組每孔加入800 μL 28 mmol/L麥芽糖溶液和200 μL PBS；陽(yáng)性對(duì)照組每孔加入800 μL 28 mmol/L麥芽糖溶液和200 μL阿卡波糖溶液，使阿卡波糖終質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL；實(shí)驗(yàn)組每孔加入800 μL 28 mmol/L麥芽糖溶液和200 μL EEB，使EEB終質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL；置37 ℃反應(yīng)40 min后移入冰浴，迅速吸出反應(yīng)液50 μL，分別加入200 μL的葡萄糖試劑盒中，37 ℃反應(yīng)30 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A并記錄，計(jì)算抑制率及IC[18-19]。50

酶活力單位定義：每分鐘分解1.0 μmol/L底物為一個(gè)酶活力單位[20]。按公式（3）計(jì)算二糖酶活力。

式中：c為反應(yīng)所釋放的葡萄糖濃度/（μmol/L）；N為樣品稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間/min；B為1個(gè)單位的二糖分解后葡萄糖釋放量（即麥芽糖B為2）。

1.3.6 EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型葡萄糖吸收的影響

實(shí)驗(yàn)在24 孔板的單層細(xì)胞上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS洗3 次，除去細(xì)胞表面附著物。加入含EEB的PBS 0.4 mL，置37 ℃孵育10 min后加入0.55 mmol/L的葡萄糖溶液1.6 mL，使EEB終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL；空白組以0.4 mL PBS代替含EEB的溶液。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，迅速吸出溶液，用冰冷（4 ℃）PBS洗細(xì)胞3 次，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎，分別測(cè)定細(xì)胞中葡萄糖及蛋白質(zhì)含量[21]。細(xì)胞葡萄糖含量測(cè)定采用氧化酶-葡萄糖試劑盒法；細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[22]。

1.3.7 EEB成分分析

取干燥樣品EEB置于安培瓶中，無(wú)水分殘留，否則會(huì)影響衍生化的效果。以1∶1（V/V）的比例加入衍生化試劑，含0.1% TMCS的BSTFA，將安培瓶口封好，超聲波處理1 h，放入100 ℃的烘箱中加熱，取出后冷卻至室溫。

氣相色譜檢測(cè)條件：進(jìn)樣量為1 μL，分流進(jìn)樣，分流比30∶1；Rtx-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；程序升溫柱溫設(shè)置：柱初溫50 ℃，升溫速率6 ℃/min，升至250 ℃，繼續(xù)升溫，速率15 ℃/min，升至280 ℃，保持時(shí)間不少于10 min；接口溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度270 ℃。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度220 ℃，電離電壓70 eV，倍增器電壓350 V，掃描范圍33～500 amu，掃描速率0.5 s/次[23-24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3 次取平均值，表示為x±s，所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件處理，用Duncan’s法進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

圖2 大孔樹脂分離純化后各成分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.2 Anti-α-glucosidase activity of the fractions separated from the 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves by macroporous resin adsorption

經(jīng)大孔樹脂動(dòng)態(tài)純化后的杜仲葉乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，由圖2可知，EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，為（43.08±0.55）%；其次是EEC，（26.74±0.32）%，比EEA高1.14%；而EED抑制率只有（13.87±0.20）%，是5 個(gè)組分中最低的。

2.2 EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)

圖3 EEB的Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curve of EEB

由圖3可知，最大反應(yīng)速率（Vmax）隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增大保持不變，米氏常數(shù)（Km）增大，說明了EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶底物在該酶上的絡(luò)合位點(diǎn)相同，互相競(jìng)爭(zhēng)，屬競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程1/Km’=1/{Km（1+[I]/Ki）}，從圖3中求得EEB質(zhì)量濃度為10、20 mg/mL時(shí)Km’，再根據(jù)α-葡萄糖苷酶的Km和Vmax，可求出EEB質(zhì)量濃度為10、20 mg/mL時(shí)Ki的均值為32.90 mg/mL。

2.3 EEB的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

圖4 不同質(zhì)量濃度EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of EEB on the growth of Caco-2 cells

由圖4可知，在0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL條件下吸光度A570nm分別為0.818±0.046、0.849±0.015、0.849±0.033、0.783±0.053、0.767±0.118、0.774±0.037。實(shí)驗(yàn)組與空白組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這說明實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下，EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

2.4 Caco-2細(xì)胞中EEB的降血糖機(jī)制

2.4.1 EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型的α-葡萄糖苷酶抑制作用

圖5 EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶酶活性的抑制作用Fig.5 Anti-α-glucosidase activity of EEB in Caco-2 cells

如圖5所示，EEB在以麥芽糖為底物時(shí)對(duì)Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。當(dāng)EEB質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL時(shí)，抑制率分別為（19.50±1.93）%、（32.07±1.08）%、（44.21±3.34）%、（49.11±3.78）%、（51.75±2.15）%。其IC50值為0.57 mg/mL。隨著EEB質(zhì)量濃度的升高，α-葡萄糖苷酶活性逐漸降低，說明其抑制α-葡萄糖苷酶活性具有質(zhì)量濃度依賴性。

2.4.2 EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型葡萄糖吸收的影響

圖6 EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞的葡萄糖吸收抑制作用Fig.6 Anti-absorption of glucose of EEB in Caco-2 cells

如圖6所示，空白組中葡萄糖吸收量為3.018 μmol/mg；添加EEB的實(shí)驗(yàn)組中，Caco-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收量出現(xiàn)一定程度的降低。隨著EEB質(zhì)量濃度的上升，抑制率逐漸上升。這說明EEB對(duì)Caco-2細(xì)胞模型葡萄糖吸收有一定的抑制作用，1 mg/mL時(shí)抑制率為（26.25±0.86）%。

2.5 EEB硅烷化衍生物GC-MS分析

EEB的GC-MS總離子流圖如圖7所示。其中一部分化合物由于含量少或者無(wú)法衍生化為揮發(fā)性物質(zhì)，故無(wú)法確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，也有一部分為雜峰，予以扣除后通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索和人工解吸相結(jié)合，分析EEB中主要降血糖成分，結(jié)果見表1。

圖7 EEB的總離子流圖Fig.7 TIC profileof EEB

表1 EEB中抑制-葡萄糖苷酶成分的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of -glucosidase inhibitors in EEB

由表1可知，EEB主要以內(nèi)酯類、有機(jī)酸、酚類、單糖類、醇類、氨基酸為主。除此之外，還有核苷、醚類、胺類、烯烴類化合物。

EEB成分中含有的內(nèi)酯類化合物相對(duì)含量最高，為16.75%。這其中DL-異檸檬酸內(nèi)酯的相對(duì)含量最高，達(dá)到了13.79%，其次為D-甘露糖酸-1,4-內(nèi)酯（0.73%），D-葡萄糖酸-1,4-內(nèi)酯（2.23%）。EEB成分中含有的有機(jī)酸種類最多，包含飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸以及芳香族脂肪酸。飽和脂肪酸中主要含有草酸（0.95%）、乳酸（0.57%）等；不飽和脂肪酸主要含有2-酮-D-葡萄糖酸（2.63%）、10,12-二十二碳二炔二酸（1.42%）（表中未列出）等；芳香族脂肪酸中2,6-二羥基-苯甲酸含量較高，為2.11%。酚類化合物總相對(duì)含量為4.36%，分別為百里酚（0.67%），鄰羥基苯乙醇（0.46%），3,4-二羥基-苯丙烯酸（1.9%），兒茶素（0.88%），4-羥基-3-甲氧基苯乙二醇（0.45%）。EEB還檢測(cè)到左旋葡聚糖（0.62%）、阿拉伯呋喃糖（1.46%）、呋喃半乳糖（1.81%）、吡喃葡萄糖（3.09%）、吡喃甘露糖（2.37%）、D-巖藻糖（0.65%）等單糖類化合物。就氨基酸而言，5-氧代脯氨酸相對(duì)含量為0.54%；4-羥基脯氨酸相對(duì)含量為1.25%。醇類物質(zhì)而言，3,4-雙脫氧己糖醇相對(duì)含量為0.54%；桃金娘烯醇為0.54%。此外，EEB中還含有0.7%甲酚甘油醚；0.77%苯胺羰酸；0.45% VB6等物質(zhì)。

3 討 論

小腸絨毛壁上皮的二糖酶系豐富，可引起餐后血糖升高，其中最重要的是α-葡萄糖苷酶[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，杜仲葉20%乙醇解吸物（EEB）有很強(qiáng)的體外抗α-葡萄糖苷酶活性，并且EEB與α-葡萄糖苷酶有較高的親和性（Ki值為32.90 mg/mL）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EEB對(duì)于Caco-2細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶活性也具有較強(qiáng)抑制作用，并且可以抑制Caco-2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。GC-MS分析表明，杜仲葉EEB含有重要的抗α-葡萄糖苷酶成分，包括百里酚、兒茶素、2,6-二羥基-苯甲酸、3,4-二羥基-苯丙烯酸和DL-異檸檬酸內(nèi)酯等成分，含量最高可達(dá)13.79%。

正常人進(jìn)食后，食物中的碳水化合物如淀粉先在α-淀粉酶作用下生成麥芽糖、麥芽三糖等，隨后經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解作用生成葡萄糖等，經(jīng)腸壁細(xì)胞吸收而被機(jī)體利用。因此抑制α-葡萄糖苷酶活性，阻礙二糖進(jìn)一步分解對(duì)于延緩餐后血糖值升高有著重要作用?，F(xiàn)在研究多采用PNPG為底物的酶-抑制劑模型，篩選強(qiáng)活性的α-葡萄糖苷酶抑制劑。但是這種模型無(wú)法直接評(píng)價(jià)篩選得到的降糖物質(zhì)在體內(nèi)的藥效作用，存在假陽(yáng)性率高、體內(nèi)外活性差異較大、臨床效果不理想等弊端[26]。因此本實(shí)驗(yàn)在采用PNPG為底物的酶-抑制劑模型基礎(chǔ)上，借助Caco-2細(xì)胞模擬人體小腸壁環(huán)境，克服了體內(nèi)外活性差異大等缺點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上研究了EEB降血糖機(jī)制。Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，體外培養(yǎng)達(dá)到融合后，可自然分化為與成熟小腸細(xì)胞具備類似形態(tài)和生化特性的細(xì)胞。目前Caco-2細(xì)胞主要用于藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究，可表現(xiàn)出與人小腸上皮細(xì)胞相似的與糖消化、吸收有關(guān)的酶以及蛋白質(zhì)[27]。故可借助Caco-2細(xì)胞所表達(dá)的α-葡萄糖苷酶構(gòu)建模型來(lái)研究EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用。

首先在酶-抑制劑模型中，EEB抑制率最高，為（43.08±0.55）%。其次酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EEB對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制且Ki值僅為32.90 mg/mL，這說明EEB與α-葡萄糖苷酶有很高的親和性。之后進(jìn)一步利用Caco-2細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，EEB以麥芽糖為底物時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制率。EEB抑制α-葡萄糖苷酶活性隨著EEB質(zhì)量濃度升高而升高，IC50值為0.57 mg/mL。對(duì)比常用降血糖藥物-阿卡波糖在0.20 mg/mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率為67.92%，同等質(zhì)量濃度的杜仲葉乙醇提取物抑制率達(dá)到了57.57%。

葡萄糖吸收過程中主要涉及鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（sodium/glucose cotransporter-1，SGLT-1）、葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（glucose transporter 2，GLUT-2）兩種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白[28]。其中位于小腸細(xì)胞黏膜表面上的SGLT-1起主導(dǎo)作用，其在細(xì)胞基底膜Na+-K+-ATP酶作用下逆Na+濃度差，消耗能量，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[29-30]。因此，腸道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT-1、GLUT-2和Na+-K+-ATP酶共3 種蛋白。Caco-2細(xì)胞模型中，EEB除可抑制α-葡萄糖苷酶活性外還可抑制葡萄糖攝取吸收，1.00 mg/mL時(shí)抑制率26.25%。針對(duì)EEB抑制Caco-2細(xì)胞中葡萄糖吸收的具體機(jī)制尚不清楚。但研究表明，茶葉提取物可通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制Caco-2細(xì)胞膜上SGLT-1、GLUT-2、GLUT-5等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性來(lái)抑制細(xì)胞對(duì)于葡萄糖的吸收[31]。夏枯草提取物可能通過抑制SGLT-1、GLUT-2及Na+-K+-ATP酶在mRNA水平上的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生成量，從而降低葡萄糖吸收量[32]。因此，EEB可能通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性或者抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在mRNA水平上的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖吸收的抑制。

在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，可通過繼續(xù)實(shí)驗(yàn)研究在Caco-2細(xì)胞模型上EEB對(duì)于蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖等其他二糖酶的抑制效果，研究其對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響，以便于進(jìn)一步研究EEB的降血糖機(jī)制。綜上可得，EEB可通過抑制α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖吸收，起到降血糖的效果。

藥用植物中，具備抗α-葡萄糖苷酶活性的有效成分主要由多酚、黃酮及黃酮苷、生物堿、三萜及其苷類、肽類、酯類、酸類等組成[33]。GC-MS分析EEB主要成分含有酸類、單糖類、多酚、酯類、氨基酸等物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，利用高效液相色譜法分離杜仲茶甲醇提取物可得到5 種α-葡萄糖苷酶抑制劑分別為：槲皮素、兒茶素-α（7,8-b.c）-4d-（3,4-二羥基）-α（3H）吡喃糖、兒茶素-α（7,8-b.c）-4β-（3,4-二羥基）-α（3H）葡萄糖、山奈酚α-3-O-β-葡萄糖和杜仲醇[9]。本實(shí)驗(yàn)分析得到了兒茶素，含量為0.88%。由于提取分離杜仲葉方法不同，并未檢測(cè)到槲皮素、山奈酚α-3-O-β-葡萄糖和杜仲醇。但是，EEB中的其他成分可能具備抑制α-葡萄糖苷酶的活性。桂花中的脂肪酸具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性[34]。EEB成分中含有有機(jī)酸的種類最多，包含10 種飽和脂肪酸，6 種不飽和脂肪酸以及3 種芳香族脂肪酸。其中不飽和脂肪酸含量最高，達(dá)6.86%。杜仲多糖對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降血糖作用[35]?？喙隙嗵呛吞J薈多糖都有降血糖的作用，而苦瓜多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖等構(gòu)成；蘆薈多糖以甘露糖、阿拉伯糖等構(gòu)成[36]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EEB含有的單糖類化合物相對(duì)含量為13.25%，其中吡喃甘露糖含量相對(duì)較高，為2.37%；阿拉伯呋喃糖含量為1.46%；呋喃半乳糖為1.81%。茶多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制活性且延緩小腸對(duì)糖的消化吸收起到降糖作用[37]。EEB中兒茶素含量為0.88%。除此，EEB中還檢測(cè)到百里酚、3,4-二羥基-苯丙烯酸、4-羥基-3-甲氧基苯乙二醇等酚類物質(zhì)。海帶中提取得到的D-甘露醇與丙酮合成的二異亞丙基甘露醇可抑制α-葡萄糖苷酶活性[38]。EEB中可分離得到5 種醇類成分（3.27%）。EEB中內(nèi)酯類化合物的相對(duì)含量最高，為16.75%，其中DL-異檸檬酸內(nèi)酯的相對(duì)含量最高，達(dá)到了13.79%。此外，EEB中還檢測(cè)出2 種氨基酸（1.79%），分別為5-氧代脯氨酸和4-羥基脯氨酸。L-羥基脯氨酸能使正常小鼠進(jìn)食量明顯增加時(shí)而不增加體質(zhì)量增長(zhǎng)速率，減少營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型大鼠的體質(zhì)量[39]。根據(jù)以上成分結(jié)構(gòu)鑒定，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EEB含有兒茶素、百里酚、吡喃甘露糖、2,6-二羥基-苯甲酸，3,4-二羥基- 苯丙烯酸和DL-異檸檬酸內(nèi)酯等成分，含量最高可達(dá)13.79%。推測(cè)這些成分可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，為測(cè)定其在杜仲葉中的含量以及進(jìn)一步研究它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，杜仲葉乙醇提取物降血糖效果主要是通過抑制α-葡萄糖苷酶活力，減少葡萄糖吸收，降低餐后高血糖實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)從糖的消化轉(zhuǎn)運(yùn)途徑闡明了杜仲葉降血糖保健功效的原理，為杜仲葉治療糖尿病的開發(fā)利用打下了理論基礎(chǔ)。

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Ethanol Extract of Eucommia ulmoides Leaves Inhibits Alpha-Glucosidase in Caco-2 Cells

ZHANG Hong-xia, YANG Dan-dan, WANG Feng, LI Yi-jiao, FAN Jun-feng*
(College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

The inhibitory effects of 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves on alpha-glucosidase and glucose transport were investigated in Caco-2 cells in vitro to elucidate the anti-hyperglycemic mechanism of Eucommia ulmoides leaves. The alpha-glucosidase inhibitors in the ethanol extract were also identified by GC-MS analysis. The kinetic study showed that the 20% ethanol elution fraction (EEB) from macroporous resin AB-8 of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves could competitively inhibit alpha-glucosidase with a Kivalue of 32.90 mg/mL, indicating that alphaglucosidase has a strong affinity with the extract. Meanwhile, the inhibition was found to be reinforced as the concentration of EEB increased. For investigation of the inhibitory effect of EEB in Caco-2 cells, cytotoxicity assays were firstly conducted by using different concentrations of EEB (0.05, 0.10, 0.20, 0.50 and 1.00 mg/mL) to determine the safety level at which cell growth and viability could not be affected. All tested concentrations of EEB had no effect on the growth or viability of Caco-2 cells. Subsequently, EEB at various concentration exhibited effective suppression on alpha-glucosidase by using maltose (28 mmol/L) as the substrate in Caco-2 cells in a concentration-dependent manner with an IC50of 0.57 mg/mL. Furthermore, EEB could also attenuate glucose transport in Caco-2 cells, which could be decreased to 26.25% by EEB (1 mg/mL). These results indicate that EEB exerts strong anti-hyperglycemic effect by suppressing disaccharidase and glucose transportors. GC-MS analysis was conducted to elucidate the composition of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves. It was found that acids, monosaccharides, polyphenols, esters, amino acids were the main components of EEB. Further analysis by GC-MS revealed that the ethanol extract was rich in DL-isocitric acid lactone, thymol, catechin, 2,6-dihydroxybenzoic acid and 3,4-dihydroxy cinnamic acid. These compounds may play important roles in the hypoglycemic effect of the extract. The present study suggests Eucommia ulmoides leaves are a medicinal food material for preventing and treating diabetes, and could be further developed into healthful products.

Eucommia ulmoides leaves; Caco-2 cells; α-glucosidase; hypoglycemic; glucose transport; catechin

TS252.1

A

1002-6630（2014）17-0197-07

10.7506/spkx1002-6630-201417038

2013-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（J1103516）

張紅霞（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：Luludeer0305@sina.cn

*通信作者：范俊峰（1970—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹苍葱远嚯暮忘S酮的抗血栓、抗糖尿病功能。

E-mail：fanjunfeng@bjfu.edu.cn