共刺激分子CD28及CTLA-4的表達與不明原因反復流產(chǎn)的相關性研究

吳杰儒，李俊明，廖燦

(1、江西省婦幼保健院，江西 南昌330006；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

共刺激分子CD28及CTLA-4的表達與不明原因反復流產(chǎn)的相關性研究

吳杰儒1，李俊明2，廖燦1

(1、江西省婦幼保健院，江西 南昌330006；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

目的 探討CD28、CTLA-4在母胎界面的表達與原因不明復發(fā)性流產(chǎn) (URSA)的關系。方法 采集20例診斷為URSA的患者(URSA組)和20例正常早孕婦女(正常對照組)的部分蛻膜組織，采用Real-Time PCR檢測蛻膜組織中CD28、CTLA-4mRNA的表達；流式細胞術檢測蛻膜組織CD3+T細胞中CD28、CTLA-4的表達。結果 蛻膜組織中CD28mRNA的相對表達量 URSA組 （8.51×10-6±4.97×10-6） 較正常對照組高 （6.82×10-6±7.02×10-6）， 但無顯著差異。 蛻膜組織中 CTLA-4 mRNA 的相對表達量 URSA 組（2.35×10-4±3.17×10-4）較正常對照組（2.09×10-5±2.79×10-5）顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；URSA組CD28/CTLA-4比值顯著降低（P＜0.05）。蛻膜組織中CD3+CD28+T淋巴細胞亞群URSA組（65.0±7.15%）高于正常對照組（59.2±4.51%），差異無統(tǒng)計學意義。蛻膜組織中CD3+CTLA-4+T淋巴細胞亞群URSA組（4.54±3.95%）高于對照組（2.11±1.57%），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論 蛻膜組織中CD28/CTLA-4的表達異常可能與URSA的發(fā)病具有密切關系。

CD28；CTLA-4；原因不明復發(fā)性流產(chǎn)；蛻膜組織

自然流產(chǎn)是妊娠的常見結局之一，自然流產(chǎn)給每一個家庭和女性本身都帶來很大的困擾，自然流產(chǎn)發(fā)生的危險隨著妊娠丟失次數(shù)的增加而增加，其復發(fā)率受多種因素影響。除常見的胚胎染色體異常、生殖道解剖異常、內分泌異常、自身免疫疾病以及感染等因素外，臨床上40%～50%的患者流產(chǎn)原因不明確，稱為不明原因反復流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。 隨著相關研究的不斷深入，不明原因反復流產(chǎn)80%以上都與免疫因素有關，主要與妊娠免疫耐受失衡相關[1]。本研究采用RT-PCR和流式細胞術對URSA患者和正常早孕婦女的蛻膜組織中CD28、CTLA-4的表達進行檢測分析，以探討其表達情況與URSA發(fā)生中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象URSA實驗組選擇2015年7月至2016年6月期間在江西省婦幼保健院就診同意納入研究的URSA患者。患者既往無活產(chǎn)史，均排除染色體異常、生殖道解剖異常、內分泌異常、自身免疫性抗體、ABO血型不合、凝血功能異常以及感染等因素；經(jīng)臨床癥狀、婦科檢查、尿HCG、B超診斷為早期胚胎停止發(fā)育或難免流產(chǎn)者，年齡30.2±3.1歲，孕周8.3±2.5周，孕次3.2±0.6次。另選取選擇同期要求行人工流產(chǎn)的正常健康早孕婦女20例作為對照。對照組婦女既往均有活產(chǎn)史，無自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)史；排除染色體異常、內分泌紊亂、生殖道感染以及自身免疫性疾?。辉衅跓o腹痛及陰道出血；B超提示胚胎發(fā)育正常。年齡27.5±3.8歲，孕周 7.8±2.2周，孕次 2.5±0.5次。

1.2 標本采集無菌采集研究對象的部分蛻膜組織，以磷酸緩沖液（PBS）浸泡，一部分置入含有RNA保存液的冷凍管中，4℃過夜后置-80℃保存?zhèn)溆?，另一部分?～4h內進行單個核細胞的分離。

1.3 蛻膜組織單個核細胞的分離和檢測無菌采集蛻膜組織后，PBS漂洗后用眼科剪分離成大約100mg大小，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，獲取細胞懸液。離心后用Ficoll分離液梯度離心得到白色絮狀細胞層，再裂解紅細胞，離心洗滌得到蛻膜組織單個核細胞。然后分別用藻紅蛋白-得克薩斯紅(ECD)、異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）標記（美國eBioscience公司），同時設同型對照抗體；混勻后避光孵育30min，PBS洗滌，重懸后上機 （貝克曼FC500）。

1.4 RT-PCR檢測蛻膜組織中CD28/CTLA-4基因的表達取蛻膜組織約100mg，加入1ml TRIzol（Ambion公司）后勻漿，提取RNA，提取后的樣本以260/280nm檢測吸光度以判定純度。按Takara試劑說明書進行逆轉錄和RT-PCR反應。CD28引物序列：5'-CTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGT-3'（上游）；5'-CATAGGGCTGGTAATGCTTGCGGGT-3'（下游）；CTLA-4 引物序列：5'-CATGATGGGGA ATGAGTTGA-3' （上游）；5'-AGGTAGTATGGCGGTGGGTA-3'（下游）；每個樣品設三個復孔。結果采用2-△Ct法分析蛻膜組織中CD28/CTLA-4 mRNA的相對表達量。

1.5 FCM分析用流式細胞儀檢測淋巴細胞表面共刺激分子，先在FSC和SSC二位點陣圖選取淋巴細胞區(qū)域，然后再以FL1(FITC)和FL2(PE)分別檢測FITC和PE陽性的CD3+T淋巴細胞表面共刺激分子的表達，每個樣本測定30000個細胞數(shù)。用flowjo軟件分析相關檢測數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，采用Student's t-test方法對平均數(shù)之間的差異進行對比分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD28mRNA、CTLA-4mRNA在URSA組和正常對照組蛻膜組織中的表達及其比值分析 URSA組中CD28mRNA的相對表達量較正常組增高，但差異無統(tǒng)計學意義，URSA組中CTLA-4 mRNA的相對表達量顯著高于正常組 （P＜0.05），URSA組CD28/CTLA-4比值顯著小于正常對照組 （P＜0.05）。 見表 1。

表1 CD28m RNA、CTLA-4 mRNA在蛻膜組織中的相對表達量及CD28/CTLA-4比值

2.2 CD28、CGTLA-4 及 CD28/CTLA-4 比值在URSA組、正常對照組人群在蛻膜組織CD3+T細胞上表達比例分析 URSA組患者CD3+CD28+T細胞表達比例高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），URSA 組患者 CD3+CTLA-4+表達比例高于正常對照組 （P＜0.05），CD28/CTLA-4 比值顯著降低（P＜0.05）。 見表 2、圖 1。

3 討論

表2 CD28、CGTLA-4及CD28/CTLA-4比值在蛻膜組織CD3+T細胞表達比例

圖1 流式細胞技術檢測CD3+T淋巴細胞上CD28、CTLA-4的表達

正常妊娠過程中，胚胎可以看作是一種特殊的同種異體移植物。有研究顯示，正常的妊娠建立和維持取決于母體免疫系統(tǒng)尤其是子宮局部的免疫細胞能否識別并耐受胚胎抗原，而母體免疫系統(tǒng)對胚胎的識別受免疫細胞和細胞因子的調節(jié)。大量研究表明[2-4]，正常妊娠免疫主要以Th2型細胞因子介導的體液免疫為主，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等介導B細胞增殖、抗體產(chǎn)生和同種排斥反應的免疫耐受。而妊娠失敗主要由Th1型細胞因子介導的細胞免疫所致，Th1主要分泌IL-2、IFN-α、TNF-β 等，有免疫殺傷作用。T 細胞作為主要的免疫細胞在免疫耐受中起著重要作用，在獲得性免疫應答的起點和核心。根據(jù)免疫雙信號學說，參與獲得性免疫應答的主要細胞T淋巴細胞的活化需要兩個信號系統(tǒng)共同參與。第一信號由抗原提呈細胞表面的MHC/Ag復合物與相應細胞的抗原識別受體 (如T淋巴細胞的TCR/CD3)結合后提供，第二信號則由APC上的共刺激分子與淋巴細胞上相應的受體結合后介導。研究證明，淋巴細胞接觸MHC/Ag復合物后可能產(chǎn)生兩種截然不同的后果：⑴增殖、分化為不同的效應細胞；⑵無反應性或凋亡。這兩種結果的出現(xiàn)以及T細胞分化的方向主要決定于APC所傳遞的共刺激信號。

CD28/CTLA-4作為最重要的共刺激分子功能各有不同，CD28與B7結合后激活T細胞，促進T細胞克隆增殖；CTLA-4則相反是T細胞活化的抑制性分子。CD28在T細胞上為組成性表達，在靜息和活化狀態(tài)下都有表達，當它與B7結合以后能誘導產(chǎn)生細胞因子及其受體的表達。CTLA-4則不同，在靜息的T細胞上幾乎不表達，當T細胞被激活時，CTLA-4會出現(xiàn)高表達狀態(tài)，負調節(jié)共刺激信號，行使對T細胞自我穩(wěn)態(tài)調節(jié)[5]。CD28和CTLA-4與B7的結合反應了免疫的精細調節(jié)，即T細胞免疫應答開始時需要CD28的介導，而CTLA-4則對過度活化的T細胞起到抑制作用，使整個免疫應答處于平衡狀態(tài)。CTLA-4除了傳遞負性調節(jié)信號還起到其他免疫調節(jié)作用：⑴可提高T細胞活化的閾值，避免發(fā)生自身免疫反應[6，7]；⑵參與Th2細胞的分化，在缺乏CTLA-4的情況下，初始T細胞優(yōu)先向Th2分化，并分泌較高水平的IL-4、IL-5、IL-10[8，9]。 CTLA-4 的抑制機制也分為兩種，在免疫起始階段低水平表達時借助TCR處于激活狀態(tài)與胞內信使分子SHP-2、PP2A等直接傳遞抑制性信號；當CTLA-4高表達時可直接與CD28競爭結合B7分子，結合后阻斷CD28分子作用發(fā)揮，通過導致T細胞的無能或凋亡使免疫反應終止[10]。

本研究通過檢測URSA患者蛻膜組織mRNA和蛻膜組織中CD3+T細胞上CD28、CTLA-4的表達發(fā)現(xiàn)。URSA組的CD3+CD28+表達高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CD3+CTLA-4+也高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明CD3+CTLA-4+的高表達與URSA的發(fā)生相關，而CD3+CD28+表達無差異與URSA的發(fā)生不具有直接的相關性。在普遍的認識中，CD28是正向調節(jié)的共刺激分子，根據(jù)這個推論在URSA患者蛻膜組織中浸潤的T細胞應該高表達CD28，局部T細胞過度活化導致URSA的發(fā)生。而本研究的結果CD28雖然在URSA組高于對照組但差異無統(tǒng)計學意義。說明正常妊娠婦女蛻膜組織中的CD28也處于活化狀態(tài)。這與我們所認知的CD28和CTLA-4所具備的功能不符。在自身免疫疾病中往往表現(xiàn)為CD28高表達、T細胞過度激活而CTLA-4低表達，這類自身免疫疾病的機理得到廣泛承認，而在移植排斥反應中，非急性排斥反應和急性反應相比共刺激分子活性較低[11]。本研究的結果不符可能與URSA的發(fā)病機理不同有關，且不排除還受其他因素影響。其次本研究的樣本數(shù)不大可能也會影響研究結果。本研究的樣本都是在刮宮后兩小時取得的，從免疫學的角度來看，這些樣本應該是發(fā)生了排斥反應共刺激分子應該處于高表達狀態(tài)?，F(xiàn)代生殖免疫學認為[12]，正常的妊娠母胎之間是處于免疫耐受的，以保證妊娠順利進行；而免疫耐受需要適量的免疫識別和免疫反應，這種適量的免疫識別、反應引起的免疫耐受是一個主動的免疫過程，所以T細胞是產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。在正常情況下CD28表達的增加，引起的T細胞活性增加，不會對胎兒直接進行排斥反應而是通過多因素調節(jié)維持宮內的免疫耐受平衡狀態(tài)，是有利于妊娠進行的。而CTLA-4在URSA組的高表達反映了，在URSA患者中T細胞的功能反而被抑制了。由于CD28/CTLA-4具有共同的配體B7，我們單獨比較CD28和CTLA-4對于解釋T細胞的功能，會受到許多因素的干擾。所以本研究把CD28/CTLA-4的比值再做比較，通過比較正負調節(jié)因子的比值來解釋T細胞功能的調節(jié)方向以減少干擾因素，另一方面對于同一患者采用比值來比較更能說明對T細胞的調節(jié)作用。如某個體的CTLA-4很高，但CD28也很高，它的抑制作用肯定不如CTLA-4表達很高而CD28表達一般的那么強[13]。本研究發(fā)現(xiàn)CD28/CTLA-4比值URSA組顯著低于正常對照組，這提示我們在URSA組中母胎界面的T細胞功能是處于相對抑制狀態(tài)的，而正常對照組中處于相對活躍狀態(tài)。這也證明在孕期母體對胎兒的同種異體抗原進行免疫識別和免疫應答，來誘導維持正常妊娠的免疫耐受，免疫耐受并不是完全不接觸抗原，而是要接觸識別抗原，然后再通過各種環(huán)節(jié)作用，使母體再次識別抗原時不產(chǎn)生免疫效應，這個過程也是個主動的免疫過程。

也有研究顯示在URSA患者中CD28是高表達而CTLA-4是弱表達的。如張利群等人研究[8]表明URSA組蛻膜組織的CTLA-4是顯著低于妊娠組的；劉堂兵等人研究[14]發(fā)現(xiàn)孕早期自然流產(chǎn)患者的外周血CD28分子顯著高于早孕期正常妊娠者。還有研究[15]發(fā)現(xiàn)通過干預共刺激分子信號使CD28表達下調和CTLA-4表達上調能顯著降低自然流產(chǎn)模型的胚胎吸收率。以上研究顯示在母胎界面CD28的高表達和CTLA-4的低表達造成了局部或外周血T細胞過度活化導致疾病的發(fā)生。這說明在整個妊娠過程中，免疫耐受的產(chǎn)生和平衡的維持都很重要。不管是T細胞被相對抑制造成免疫耐受沒能正常適度發(fā)生還是T細胞過度活化導致免疫反應過度對胎兒造成排斥都有可能導致URSA的發(fā)生。同時T細胞的分化既影響Th1/Th2的偏移也反過來受其影響，而T細胞又受共刺激分子的作用而發(fā)生分化。CTLA-4的高表達與B7結合誘導T細胞Th1極化，Th1型細胞因子對正常妊娠的維持是不利的。

總的來說URSA的發(fā)生受多因素共同作用影響，導致疾病的發(fā)生。受條件限制本研究只從CD28和CTLA-4方面入手，發(fā)現(xiàn)相比CD28，CTLA-4在URSA發(fā)生中起到更重要的作用，同時CD28/CTLA-4比值提示我們局部T細胞被相對抑制也可能會導致URSA的發(fā)生。通過調節(jié)共刺激分子通路，使T細胞的免疫功能正常發(fā)揮，保持母胎免疫耐受的平衡，可作為研究共刺激分子與URSA患者相關性的新方向。

[1]Souza SS，et al.Immuno logical evaluation of patients with recurrent abortion[J].JReprod Immunol，2002，56：111-121.

[2]林其德，邱麗華．免疫型復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機制及診斷和治療[J]．上海交通大學學報：醫(yī)學版，2009，29(11)：1275－1278．

[3]Khan N，Gowthaman U，Pahari S，et al.Manipulation of co-stimulatory molecular by intracellular pathogens：Veni，vidi，vic.Plos Pathogens，2012，8(6)：e1002676.

[4]金伯泉.細胞和分子免疫學[M].第2版.北京：科學出版杜，2001.12.

[5]Carreno BM，Bennett F.Chau TA CTLA-4(CD152)can inhibit T cell activation by two differentmechanisms depending on its level of cell surface expression 2000(03).

[6]Murata K.Dalakas MC Expression of the co-stimulatory molecule BB-1，the ligands CTLA-4 and CD28 and theirmRNA in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy 2000.

[7]Minguela A，Marin L.Torio A CD28/CTLA-4 andCD80/CD86 costimulatory molecules are mainly involved in acceptance or rejection of human liver transplant 2000(07).

[8]張利群，潘袁，李楷濱，等.CTLA-4及協(xié)同刺激信號與孕早期不明原因反復自然流產(chǎn)的關系 [J].中國婦幼保健，2015，30(3)：405-407.

[9]呂英璞，張娜娜，郭清，等.協(xié)同刺激分子CD28、CTLA-4與子癇前期發(fā)病的關系[J].中國婦幼保健，2016，31(16)：3378-3381.

[10]呂志宇，袁正洲，榮本兵，等.來氟米特對EAE豚鼠外周血CD28/CTLA-4共刺激分子表達的影響 [J].中國生化藥物雜志，2015，35(6)：39-42.

[11]謝楠楠.聯(lián)合監(jiān)測CA125、β-HCG在先兆流產(chǎn)保胎中的價值研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2015，33（1）：86-88.

[12]張娜娜，呂英璞，楊石芳，等.早發(fā)型重度子癇前期分娩前后CD28/CTLA-4的相關研究[J].國際婦產(chǎn)科學雜志，2015(5)：533-535.

[13]邱麗華，林其德.原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面Th1/Th2平衡調控機制的研究 [C].全國生殖免疫學大會暨學術交流會，2006.

[14]劉堂兵，陳云鵬，尹中，等.妊娠期婦女的尿沉渣結果分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2013，31(2)：143-144.

[15]謝楠楠，孫軼貞，陳尤佳，等.聯(lián)合監(jiān)測CA125、β-HCG在先兆流產(chǎn)保胎中的價值研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2015，33（1）：86-88.

R714.21，R446.62，R523

A

1674-1129(2017)05-0667-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.010

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃（項目編號：20165454）

吳杰儒，男，1983年生，主管技師碩士研究生，檢驗科，主要從事臨床免疫檢驗診斷學的研究。

2017-01-20；

2017-08-09)