實(shí)體器官移植失敗患者HLA和HPA抗體篩查及特異性分析

陳大偉，夏文杰，徐秀章，鄧晶，葉欣

(廣州市廣州血液中心，廣東 廣州 510095)

實(shí)體器官移植失敗患者HLA和HPA抗體篩查及特異性分析

陳大偉，夏文杰，徐秀章，鄧晶，葉欣

(廣州市廣州血液中心，廣東 廣州 510095)

目的 了解廣州地區(qū)實(shí)體器官移植失敗患者中HLA抗體和HPA抗體的分布和特異性，初步探索HLA抗體及HPA抗體與實(shí)體器官免疫性排斥反應(yīng)的相關(guān)性。方法 隨機(jī)收集廣州地區(qū)實(shí)體器官移植失敗患者標(biāo)本136例，利用Lifecodes LifeScreen Deluxe（LMX）篩查標(biāo)本的HLA抗體，陽(yáng)性者再分別利用LIFECODES LSATMClassⅠ和LIFECODES LSATMClassⅡ（Single Antigen）鑒定抗體特異性；利用Lifecodes PAKR 2LE對(duì)HPA抗體進(jìn)行篩查，陽(yáng)性標(biāo)本利用MAIPA進(jìn)行最終確證。結(jié)果 廣州地區(qū)136例實(shí)體器官移植失敗患者中，抗-HLA陽(yáng)性率55.15%（75/136），其中HLA-Ⅰ類抗體出現(xiàn)頻率為38.97%（53/136），HLA-Ⅱ類抗體出現(xiàn)頻率為42.65%（58/136）。HLA-Ⅰ類抗體中出現(xiàn)頻率較高的分別是抗-A*02 35.85%（19/53）、 抗-B*15 47.17%（25/53） 和抗-Cw*07 28.30%（15/53），HLA-Ⅱ類抗體出現(xiàn)頻率最高者是抗-DRB1*04 39.66%（23/58）和抗-DQB1*03 46.55%（27/58）。此外，檢出HPA-5bb抗體一例。結(jié)論 初步探討了廣州地區(qū)實(shí)體器官移植失敗患者HLA抗體及HPA抗體的分布情況，證實(shí)HLA抗體與移植后的免疫排斥反應(yīng)密切相關(guān)。

實(shí)體器官移植；HLA抗體；HPA抗體；抗體篩查；抗體特異性

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，抗體介導(dǎo)的體液排斥反應(yīng)在移植物損傷過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。實(shí)體器官移植受者在接受了HLA不同的移植物后，體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA抗體而成為致敏狀態(tài)。致敏不但與急性排斥有關(guān)，而且與慢性排斥及長(zhǎng)期存活率也有關(guān)[1，2]。術(shù)前對(duì)HLA抗體進(jìn)行檢測(cè)已是國(guó)內(nèi)外移植配型中心的常規(guī)，但是對(duì)術(shù)后HLA抗體的監(jiān)測(cè)尚未引起廣泛關(guān)注。移植后特異性HLA抗體的產(chǎn)生可增加移植物急、慢性排斥反應(yīng)，縮短移植物的生存周期。本文擬通過(guò)檢測(cè)實(shí)體器官移植失敗患者抗人類白細(xì)胞抗原（HLA）抗體和抗人類血小板（HPA）抗體，了解廣州地區(qū)實(shí)體器官移植失敗患者體內(nèi)HLA抗體和HPA抗體的分布情況，初步探索移植失敗與HLA抗體和HPA抗體之間的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象的選擇隨機(jī)選取廣州血液中心臨床輸血研究所2012年至2015年間，實(shí)體器官移植失敗患者136例，其中男性74例，女性62例，年齡39.4±13.5歲，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采集靜脈全血10ml，EDTA 抗凝。

1.2 試劑與儀器LifeScreen Deluxe（美國(guó)Lifecodes，批號(hào)：3000383），LSATMClassⅠ（美國(guó) Lifecodes，批號(hào)：09172B）和 LSATMClassⅡ（美國(guó) Lifecodes，批號(hào)：10102A），PAKR 2LE（美國(guó) Lifecodes，批號(hào)：3000205），配套儀器 Luminex（美國(guó) Lifecodes，型號(hào)：Luminex 200）；酶標(biāo)板 （英國(guó)Multiscreen，批號(hào)：R2KA41796），酶標(biāo)儀（美國(guó) Biotek，型號(hào)：ELX800GTI）；水平搖床 （美國(guó)Orbital，型號(hào)：MX100-4A）；真空泵（美國(guó) Millipore，型號(hào)：WP6122050）。

1.3 抗體檢測(cè)

1.3.1 HLA抗體篩查利用LifeScreen Deluxe（LMX）試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)板中，每孔依次加入 20μl洗液、2.5μl磁珠和 7μl待測(cè)標(biāo)本血清或?qū)φ昭?，混勻，室溫下置于搖床上（200r/min），避光孵育30min；之后每孔加入 60μl洗液，混勻，轉(zhuǎn)移至過(guò)濾板中；每孔加入120μl洗液，用真空泵吸出，再重復(fù)操作2次；每孔加入25μl稀釋為1×的濃縮酶聯(lián)物 (10×的結(jié)合了藻紅蛋白的羊源抗人類IgG抗體)，室溫下，置于水平搖床上（200r/min）避光孵育30min；每孔加入120μl洗液，混合，重懸磁珠。利用Luminex儀器收集數(shù)據(jù)，采用分析軟件Launch MatchIT（version 1.00）中的 LifeScreen 進(jìn)行分析。

1.3.2 HLA抗體特異性分析根據(jù)HLA抗體篩查的情況，陽(yáng)性標(biāo)本分別進(jìn)行HLA-Ⅰ抗體和HLA-Ⅱ抗體特異性分析。利用LSATM ClassⅠ/Ⅱ（LSA）試劑盒進(jìn)行特異性分析。在酶標(biāo)板中，每孔依次加入20μl LSA磁珠和7μl待測(cè)標(biāo)本血清或?qū)φ昭?，混勻，室溫下置于搖床上（200r/min），避光孵育30min；之后每孔加入60μl洗液，混勻，轉(zhuǎn)移至過(guò)濾板中；每孔加入120μl洗液，用真空泵吸出，再重復(fù)操作2次；每孔加入25μl稀釋為1×的濃縮酶聯(lián)物，室溫下，置于水平搖床上（200r/min）避光孵育30min；每孔加入120μl洗液，混合，重懸磁珠。利用Luminex儀器收集數(shù)據(jù)，采用分析軟件Launch MatchIT（version 1.00）中的 Single Antigen 進(jìn)行分析。

1.3.3 HPA抗體篩查用超純水將濃縮洗液稀釋為1×工作液，將待檢血漿和對(duì)照血清稀釋到工作濃度；取出微孔板加工作液300μl進(jìn)行清洗，按事先安排加入50μl質(zhì)控血清和待檢血清，37℃水浴30min，洗板，除空白對(duì)照孔，其余加入1：100稀釋的酶結(jié)合物 50μl，37℃水浴 30min，洗板，加入稀釋的 PNPP 100μl，避光孵育 30min，加入 100μl終止液終止反應(yīng)，空白孔加入200μl終止液，用酶標(biāo)儀在405或者410nm處讀取各孔吸光度。

1.3.4 HPA抗體確證利用血小板抗原單克隆抗體特異性免疫固定檢測(cè)（MAIPA）進(jìn)行HPA抗體的確證。用coating buffer將羊抗人IgG稀釋包被于96孔平底板中，4℃孵育過(guò)夜；采集已知HPA特異性的O型供者全血，分離血小板；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要的格局，向96孔U型板中加入相應(yīng)的血小板懸浮液，100μl/孔； 加入待檢血漿，25μl/孔， 震蕩混勻，37℃孵育30min；利用TBS/BSA緩沖液去除未結(jié)合的免疫球蛋白；利用TBS/BSA緩沖液稀釋鼠抗人單克隆抗體，加入U(xiǎn)型板中，40μl/孔，重懸血小板；利用TBS/BSA緩沖液去除未結(jié)合的單克隆抗體；向U型板中加入Solubilization緩沖液，4℃孵育30min，充分裂解血小板膜；從U型板上清中吸取100μl裂解液，加入已包被的平底板相應(yīng)的孔中，4℃孵育90min；用Tween洗液去除未結(jié)合的裂解蛋白；將過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗人IgG用Tween洗液按 1：6000 稀釋，100μl/孔加入平底板中，4℃孵育90min；用Tween洗液去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；每孔加入100μl OPD溶液，室溫顯色20-30min，每孔加入100μl終止液終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀讀板，波長(zhǎng)490mm。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)體器官移植失敗患者HLA抗體篩查情況136例實(shí)體器官移植失敗患者，HLA抗體陽(yáng)性率為55.15（75/136），男性患者中HLA抗體陽(yáng)性率為51.35（38/74），女性患者中HLA抗體陽(yáng)性率為59.68（37/62），見表 1。

2.2 實(shí)體器官移植失敗患者HLA抗體特異性分析分別對(duì)53例HLA-Ⅰ類抗體陽(yáng)性和58例HLA-Ⅱ類抗體陽(yáng)性的患者進(jìn)行HLA抗體特異性分析。HLA-I類抗體中出現(xiàn)頻率較高的有A*24、A*02、B*15、B*35、Cw*07 和 Cw*17 等，見表 2，3。

表1 實(shí)體器官移植失敗患者HLA抗體篩查結(jié)果（%）

2.3 實(shí)體器官移植失敗患者HPA抗體篩查及特異性分析對(duì)136例血清進(jìn)行HPA抗體篩查及特異性分析，僅發(fā)現(xiàn)一例HPA抗體陽(yáng)性，經(jīng)MAIPA鑒定為HPA-5bb抗體，合并出現(xiàn)HLA抗體。

3 討論

人類白細(xì)胞抗原（HLA）是介導(dǎo)器官移植排斥反應(yīng)的主要分子，患者在多次輸血、妊娠或者移植后受到同種HLA免疫致敏可產(chǎn)生群體反應(yīng)性抗體（PRA），且影響移植物長(zhǎng)期存活[3]。一項(xiàng)多中心研究表明術(shù)后出現(xiàn)HLA抗體的受者移植腎功能喪失的發(fā)生率明顯高于未出現(xiàn)抗HLA抗體的患者[4]。鄧晶[5]等對(duì)廣州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血員HLA抗體的分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其HLA抗體出現(xiàn)的頻率為3.53%（13/368）。本研究對(duì)廣州地區(qū)2012年至2015年間136例實(shí)體器官移植失敗的患者進(jìn)行HLA抗體分布調(diào)查，發(fā)現(xiàn)實(shí)體器官移植失敗的患者HLA抗體頻率為55.15%（75/136），與廣州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血員[5]相比差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 53名實(shí)體器官移植失敗患者HLA-Ⅰ類抗體的特異性

表3 58名實(shí)體器官移植失敗患者HLA-Ⅱ類抗體的特異性

Harris PE[6]等研究發(fā)現(xiàn)抗HLA-I類抗體可降低移植腎存活率，并能明顯增加排斥反應(yīng)的發(fā)生，而HLA-II類抗體對(duì)移植腎的長(zhǎng)期存活可能有影響。不同區(qū)域和種族之間HLA抗原分布不同，地域抗原的特異性導(dǎo)致HLA抗體分布的差異，高頻抗原誘發(fā)產(chǎn)生高頻抗體[7]。本試驗(yàn)中出現(xiàn)頻率較高的HLA-I類特異性抗體分別有 HLA-A*11，A*23，B*18，B*14，Cw*03和Cw*12等，對(duì)照本實(shí)驗(yàn)室建立的健康獻(xiàn)血者血小板HLA基因庫(kù)[8]，抗體特異性與基因庫(kù)中頻率較高的特異性抗原基本一致。此外，研究表明HLA-DRB1與多種自身免疫性疾病和感染性疾病相關(guān)，還與器官移植前供者與受者的配型相關(guān)[9，10]。目前，世界衛(wèi)生組織命名的HLADRB1等位基因超過(guò)了460種，具有高度的多態(tài)性，與種族，地域有一定的相關(guān)性，各地區(qū)又有其自身的特點(diǎn)[11-13]。孫瑜等[14]對(duì)江西地區(qū)漢族造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者的HLA-DRB1基因多態(tài)性進(jìn)行了分析研究，其中基因頻率最高的是DRB1*04（15.2%）。

Gorgi Y[15]等對(duì)法國(guó)地區(qū)腎移植與人血小板抗原多態(tài)性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)位于GPIIb/IIIa糖蛋白上的HPA-4b作為一種獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素，可影響腎移植的排斥反應(yīng)。根據(jù)夏文杰等[16]對(duì)廣東地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者HPA基因型的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)HPA-4b出現(xiàn)的頻率為0，故暫不必考慮其對(duì)器官移植的影響。根據(jù)Kotzampasaki EM等[17]對(duì)HPA-5的研究發(fā)現(xiàn)，HPA-5錯(cuò)配可能會(huì)導(dǎo)致移植后移植物抗宿主病的發(fā)生。本研究中，在實(shí)體器官移植失敗的患者中發(fā)現(xiàn)一例HPA-5bb抗體合并HLA抗體。考慮到HPA抗體對(duì)實(shí)體器官移植的影響尚未達(dá)到統(tǒng)一認(rèn)可，而且本研究患者例數(shù)較少，擬通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

眾多研究表明，HLA抗體是實(shí)體器官移植的高危因素，本研究亦發(fā)現(xiàn)實(shí)體器官移植失敗患者中HLA抗體出現(xiàn)的頻率明顯高于普通人群，再次證實(shí)HLA抗體與器官移植之間的密切關(guān)系。

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Screening and analysis of HLA and HPA antibodies in patients w ith failed solid organ transplantation

CHEN Dawei，XIA Wenjie，XU Xiuzhang，DENG Jing，YE Xin.
Guangzhou Blood Center，Guangzhou 510095，China.

Objective To elucidate the distribution of HLA/HPA antibodies in patients with failed solid organ transplantation in Guangzhou and identify the specificities of the HLA/HPA antibodies.To explore the relationship between HLA/HPA antibodies and rejection reaction of organ transplantation preliminarily.M ethods Random ly collected blood samples of 136 patients with failed solid organ transplantation.Screened all sampleswith Lifecodes LifeScreen Deluxe(LMX)for HLA antibody test and carried out the antibody specificity detection in the positive samples with LIFECODES LSATMClass I and LIFECODES LSATM Class II(Single Antigen)；Screened all sampleswith Lifecodes PAKR 2LE for HPA antibody testand carried out the antibody specificity detection in the positive sampleswith MAIPA.Results Among 136 patientswith failed solid organ transplantation in Guangzhou，the positive rate of HLA antibodies was 55.15%(75/136)，the frequency of HLA-I antibody and HLA-II antibody were 38.97%(53/136)，42.65%(58/136).The highest frequencies of HLA-I alloantibodies were anti-A*02 35.85%(19/53)，anti-B*15 47.17%(25/53)，anti-Cw*07 28.30%(15/53)，while themost HLA-IIalloantibody were anti-DRB1*04 39.66%(23/58)and anti-DQB1*03 46.55%(27/58).Besides，HPA-5bb antibody was detected in only one sample.Conclusion The study obtained the information about the frequency of HLA/HPA antibodies in the failed patientswith solid organ transplantation in Guangzhou，and the HLA antibodies were closely related to the immune rejection after transplantation.

Solid organ transplantation；HLA antibody；HPA antibody；Antibody screening；Specificities of antibodies

R446.62，R617

A

1674-1129(2017)05-0646-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.004

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2016616），廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（20171A011281），廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201707010021）。

陳大偉，男，1988年生，碩士研究生，主要從事血小板免疫方面的研究。

葉欣，女，1968年生，主任醫(yī)師，主要從事HLA抗原抗體檢測(cè)及血小板免疫方面的研究。

2017-04-14；

2017-08-10)