射干合劑2015年版《中華人民共和國藥典》微生物檢查方法適用性研究

田懷平 王玲 杜毅 唐躍年

摘要：目的 建立符合2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）要求的射干合劑的微生物限度檢查方法。方法 采用2015年版《中國藥典》方法對射干合劑進行微生物限度檢查方法學驗證。薄膜過濾法進行樣品前處理，使用6種菌株分別進行微生物計數(shù)檢查和限度菌檢查的方法適用性研究。結(jié)果 微生物計數(shù)檢查的5種菌株的回收比值均在0.5～2之間，控制菌檢查的大腸埃希菌檢出合格。結(jié)論 射干合劑的微生物限度檢查方法經(jīng)驗證符合2015年版《中國藥典》要求。

關(guān)鍵詞：射干合劑；微生物計數(shù)檢查；限度菌檢查；薄膜過濾法；中華人民共和國藥典

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.017

中圖分類號：R927.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0072-04

Study on Applicability of Microbiological Examination Methods for Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015 TIAN Huai-ping， WANG Ling， DU Yi， TANG Yue-nian （Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

Abstract： Objective To standardize the method of microbiological examination on Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015. Methods Chinese Pharmacopoeia 2015 was used. Microbial enumeration test and specified microorganisms test were used to verify Shegan Mixture. The samples were treated by membrane filtration. Six kinds of strains for microbiological counting and limiting bacteria were used to study applicability. Results Microbial counts of the five strains of the recovery ratio were between 0.5 to 2， and Escherichia coli tested by control bacteria was qualified. Conclusion The microbiological examination methods for Shegan Mixture can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia 2015.

Key words： Shegan Mixture； microbial enumeration test； specified microorganisms test； membrane filtration method； Chinese Pharmacopoeia 2015

射干合劑為本院臨床應(yīng)用多年的醫(yī)院制劑，是著名兒科名家時毓民的經(jīng)驗方，由麻黃（炙）、射干、黃芩、前胡、苦杏仁、僵蠶、蔊菜、蟬蛻、百部（炙）等組成，具有宣肺清熱、止咳祛痰平喘的功效，常用于治療感冒咳嗽、急性支氣管炎及哮喘性支氣管炎引起的咳嗽、多痰等癥狀。該制劑委托上海方心制藥科技有限公司生產(chǎn)（批準文號：滬藥制字Z04180745，執(zhí)行標準SYZ-ZF-017-2004），常規(guī)質(zhì)量控制檢查包括鑒別、裝量、含量測定和微生物檢查等[1]。

2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）的微生物檢查法與2010年版比較，在培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和檢驗方法等方面有重大改變[2]?，F(xiàn)有

基金項目：上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金（2012G003A）

通訊作者：唐躍年，E-mail：tyn2018@163.com

制劑的微生物檢查方法，應(yīng)按照新版《中國藥典》調(diào)整，并進行方法適用性檢查，但此類研究報道較少。本試驗按照2015年版《中國藥典》要求，對射干合劑的微生物限度檢查法進行方法適用性驗證研究，以期為藥品質(zhì)量控制部門采用新版《中國藥典》進行微生物檢查和質(zhì)量分析提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ME204電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；CLG-32L高壓蒸汽滅菌鍋，日本ALP CO.，Ltd.公司；M017生物安全柜，Thermo Fisher Scientific；SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HTY-APL01集菌儀，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；集菌培養(yǎng)器，型號KSF330，批號20161105，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；PYX-DHS40*50電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械一廠；MJ-250I霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Microflex LT質(zhì)譜儀，德國布魯克道爾頓公司。

1.2 藥物

射干合劑，本院委托上海方心制藥科技有限公司生產(chǎn)的外加工制劑，批號分別為151201、160913、160914，規(guī)格100 mL/瓶，有效期限12個月。

1.3 微生物限度標準

射干合劑為非無菌不含藥材原粉的中藥口服液體制劑。2015年版《中國藥典》四部1107微生物限度標準：需氧菌總數(shù)不超過102 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為200），霉菌和酵母菌總數(shù)不超過101 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為20）。不得檢出大腸埃希菌（1 mL）[2]。

1.4 培養(yǎng)基和稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic Soy Agar，TSA，批號20160107），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Sabouraud Dextrose Agar Medium，SDA，批號20160126），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Trypticase Soytone Broth，TSB，批號20160219），麥康凱液體培養(yǎng)基（MacConkey Broth，Mac B，批號20160902），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey Agar，Mac A，批號150929）。配制好的培養(yǎng)基采用121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，高壓蒸汽滅菌采用3M1292生物指示劑（批號20160428，美國3M公司）驗證合格。培養(yǎng)基全部產(chǎn)自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。稀釋液為本院制劑室生產(chǎn)的0.9%無菌氯化鈉溶液，質(zhì)量檢查合格。每批次培養(yǎng)基均按照2015年版《中國藥典》要求，進行與對照培養(yǎng)基驗證試驗，適用性檢查合格[2]。

1.5 菌種

需氧菌總數(shù)使用TSA培養(yǎng)基檢查，菌種為金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B） 10104]、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，CMCC（B） 63501]、白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F） 98001]和黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]；霉菌和酵母菌總數(shù)使用SDA培養(yǎng)基檢查，菌種為白色念珠菌和黑曲霉。控制菌檢查使用Mac B和Mac A培養(yǎng)基，試驗菌種為大腸埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B）44102]。試驗菌種均為中國食品藥品檢定研究院提供的0代菌種，試驗前傳代至第3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗菌液的制備

按照2015年版《中國藥典》四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（1105）和控制菌檢查法（1106）的方法，分別制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉和大腸桿菌的菌液[2]。接種的驗證菌為傳代至第3代的菌種，菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，各菌種的稀釋倍數(shù)在10-6～10-8之間，最終試驗組接種量為1 mL含菌50～100 cfu。菌液制備后，室溫放置則2 h內(nèi)使用，若保存在2～8 ℃則24 h內(nèi)使用。

2.2 供試液的制備

將射干合劑混勻，量取10 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至100 mL，混勻，為1∶10的供試液。量取1∶10供試液10 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至100 mL，混勻，為1∶100供試液。供試液制備后1 h內(nèi)完成接種。

2.3 微生物計數(shù)檢查分組

計數(shù)檢查方法驗證時，檢品分為4組，每種菌株分別制備加菌試驗組和菌液對照組，每種培養(yǎng)基分別制備供試品對照組和陰性對照組。由于射干合劑含多種有抑菌作用中藥，因此采用薄膜過濾法消除樣品的抗菌活性。①加菌試驗組：分別取1∶10供試液和1∶100供試液各10 mL，使用集菌培養(yǎng)器進行薄膜過濾，0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后一次的沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌。②供試品對照組：分別取1∶10供試液和1∶100供試液同上操作，最后一次沖洗液不加菌。③菌液對照組：用稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液代替供試液，其余同加菌試驗組操作，最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌。④陰性對照組：用0.9%無菌氯化鈉溶液代替供試液，其余同加菌試驗組操作，最后一次沖洗液不加菌。

2.4 微生物計數(shù)檢查回收試驗

分別將“2.3”項下1∶10供試液和1∶100供試液的4組濾膜取出，菌面朝上貼于TSA或SDA培養(yǎng)基平板上，不同培養(yǎng)基接種不同菌種，培養(yǎng)條件不同。TSA平板接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌時，33 ℃培養(yǎng)不超過3 d；接種白色念珠菌和黑曲霉時，33 ℃培養(yǎng)不超過5 d。SDA平板接種白色念珠菌和黑曲霉，23 ℃培養(yǎng)不超過5 d。每株試驗菌制備2個平皿，取菌落數(shù)平均值作為計數(shù)培養(yǎng)結(jié)果。2種培養(yǎng)基分別進行供試品對照組和陰性對照組計數(shù)。3個批號樣品進行3次獨立平行試驗。計算各試驗菌的計數(shù)檢查回收比值。

回收比值=（加菌試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）÷菌液對照組菌落數(shù)。

2.5 微生物控制菌檢查

2.5.1 菌液驗證組 取“2.2”項下1∶10供試液和1∶100供試液各10 mL，使用集菌培養(yǎng)器進行薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后一次的沖洗液中加入50～100 cfu大腸埃希菌。集菌培養(yǎng)器中加入100 mL TSB培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)18～24 h。取培養(yǎng)物1 mL，接種至100 mL Mac B培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)24～48 h，取Mac B培養(yǎng)物劃線接種于Mac A平板上，33 ℃培養(yǎng)18～72 h，若有菌落生長，使用Microflex LT質(zhì)譜儀進行分離純化鑒定，判斷是否檢出大腸埃希菌。

2.5.2 供試品對照組和陰性對照組 取“2.2”項下1∶10供試液和1∶100供試液，按“2.5.1”項下操作，最后一次沖洗液不加菌，為供試品對照組。用稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液代替供試液，最后一次沖洗液不加菌，為陰性對照組。這2組同“2.5.1”項下操作，取Mac B培養(yǎng)物劃線接種于Mac A平板上，33 ℃培養(yǎng)18～72 h，觀察是否有菌落生長。若有菌落生長，進行分離純化鑒定并排查原因。

若菌液驗證組檢出大腸埃希菌，供試品對照組和陰性對照組均未檢出大腸埃希菌，可認為射干合劑的供試液制備及控制菌檢查方法適用性驗證合格。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查的驗證結(jié)果

對1∶10供試液和1∶100供試液用薄膜過濾法處理后，進行3個批次的3次獨立平行試驗，計算各驗證菌的計數(shù)檢查回收比值，結(jié)果所有菌種的回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)。認為1∶10和1∶100稀釋法制備供試液計數(shù)檢查回收比值均合格，適用性驗證合格。為簡化操作步驟，建議進行1∶10稀釋制備供試液即可。結(jié)果見表1、表2。

3.2 控制菌檢查的驗證結(jié)果

3個批次的射干合劑，采用1∶10和1∶100稀釋制備供試液，經(jīng)薄膜過濾法處理，菌液驗證組均可檢出大腸埃希菌，供試品對照組和陰性對照組均未見菌落生長。認為采用1∶10和1∶100供試液制備進行預(yù)處理，培養(yǎng)條件和劃線培養(yǎng)方法進行控制菌檢查，適用性驗證均合格。建議1∶10稀釋制備供試液即可。結(jié)果見表3。

4 討論

加強中藥制劑生產(chǎn)的監(jiān)督管理和質(zhì)量控制，是中藥制劑的生存和發(fā)展基礎(chǔ)[3]。微生物檢查是藥品質(zhì)量控制的重要內(nèi)容[4-5]。中藥制劑由于成分復雜，對微生物檢查造成一定干擾。射干合劑所含8味中藥大多有抑菌作用，傳統(tǒng)的常規(guī)稀釋法不能完全消除抑菌組分對微生物檢出的干擾，而薄膜過濾法能夠更好地去除干擾，消除抗菌活性。

本研究稀釋液和沖洗液均采用2015年版《中國藥典》許可的0.9%氯化鈉滅菌溶液，與之前的蛋白胨溶液比較，獲取便利，成本降低。驗證結(jié)果表明，用薄膜過濾法處理，微生物計數(shù)檢查驗證所有菌種的回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，控制菌檢查大腸埃希菌合格。

2015年版《中國藥典》對微生物限度檢查做了較大修訂，完善了微生物計數(shù)和控制菌檢查體系，質(zhì)量要求和安全性控制更加嚴格和合理。需氧菌總數(shù)采用TSA培養(yǎng)基代替了營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌和酵母菌總數(shù)采用SDA培養(yǎng)基替代了玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，更適合樣品中微生物的復蘇生長，提高了檢測靈敏度[6]。控制菌檢查選用TSB培養(yǎng)基代替營養(yǎng)肉湯進行預(yù)增菌，增加了受傷菌株的復壯培養(yǎng)，可以提高檢出率，防止漏檢[7]。需氧菌計數(shù)檢查的驗證菌種用銅綠假單胞菌代替2010年版《中國藥典》的大腸埃希菌，銅綠假單胞菌的菌落形態(tài)穩(wěn)定，更適合用于需氧菌總數(shù)測定的方法驗證性研究[6]。

綜上，射干合劑的微生物檢查方法適用性合格，薄膜過濾法進行處理有效消除了藥品組分的抗菌活性，符合2015年版《中國藥典》要求，可以為同類藥品進行微生物限度檢查提供參考。

參考文獻：

[1] 朱鵬程，吳敏，唐躍年，等.射干合劑的定性及定量質(zhì)量控制標準研究[J].中國醫(yī)藥導報，2016，13（12）：20-23.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：136-151.

[3] 張曉萌，劉文娜，裴桂芳.醫(yī)院中藥制劑研發(fā)思路與組織管理[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（7）：8-9.

[4] 胡昌勤.藥品微生物控制現(xiàn)狀與展望[J].中國藥學雜志，2015，50（20）：1747-1751.

[5] 關(guān)洪全.控制微生物污染中藥材的幾點思考[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2000，7（6）：7-8.

[6] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.中國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計數(shù)法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）：1101-1107.

[7] 楊曉莉，李輝，馬英英，等.《中國藥典》2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師，2016，19（4）：748-752.

（收稿日期：2017-04-19）

（修回日期：2017-05-11；編輯：陳靜）