調(diào)心方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響

王曉雯++鄧海燕++王健++徐穎

摘要：目的 觀察調(diào)心方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默?。ˋD）小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將54只3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠隨機(jī)分為模型組、調(diào)心方組和陽(yáng)性藥組，以同月齡同性別18只C57BL/6J野生小鼠作為正常組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。給藥12周后，進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)和離體電生理記錄。結(jié)果 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)與模型組比較，調(diào)心方組逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短（P<0.01）；空間探索實(shí)驗(yàn)與模型組比較，調(diào)心方組小鼠穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.05，P<0.01）。在離體海馬電生理誘導(dǎo)中，與模型組比較，調(diào)心方組海馬興奮性突觸后電位斜率明顯增強(qiáng)（P<0.01），海馬雙脈沖易化無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 調(diào)心方可有效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)突觸可塑性，具有認(rèn)知保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：調(diào)心方；Morris水迷宮；海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；阿爾茨海默??；學(xué)習(xí)記憶能力；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.010

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）10-0040-04

Effects of Tiaoxin Formula on Spatial Learning and Memory Ability and LTP in Hippocampus of APP/PS1 Double Transgenic Mice with Alzheimer Disease WANG Xiao-wen， DENG Hai-yan， WANG Jian， XU Ying （Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Tiaoxin Formula on spatial learning and memory ability and long-term potentation （LTP） in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice with Alzheimer disease； To discuss its mechanism of action. Methods Totally 54 three-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into model control group， Tiaoxin Formula group and positive control group， with 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/6J wild mice were chosen as normal control group. All administration groups receive relevant medicine. 12 weeks later， Morris water maze test was used to test behavior and in vitro electrophysiology record. Results The Morris water maze test showed that in place navigation test， compared with the model control group， escape latency time in Tiaoxin Formula group was significantly reduced （P<0.01）. In the space experiments， compared with the model control group， the number of crossing the platform quadrant and the time staying at the platform quadrant in Tiaoxin Formula group were significantly increased （P<0.05， P<0.01）. In vitro hippocampal electrophysiological induction， compared with the model control group， fEPSP slope in the hippocampus in Tiaoxin Formula group were significantly increased （P<0.01）， the PPF had no significant difference （P>0.05）. Conclusion Tiaoxin Formula can improve the spatial learning and memory ability and LTP of APP/PS1 transgenic mice with Alzheimer disease， thus can realize cognitive protection effects.

Key words： Tiaoxin Formula； Morris water maze； LTP in hippocampus； Alzheimer disease； learning and memory ability； miceendprint

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是常見

基金項(xiàng)目：上海市自然科學(xué)基金（13ZR1439700）

通訊作者：王健，E-mail：wangjiantcm@126.com；徐穎，E-mail：ying6122003@aliyun.com

于老年人群的一種不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆最常見的類型。AD早期癥狀主要有漸進(jìn)性記憶的減退、認(rèn)知功能下降等，后期常出現(xiàn)抑郁、焦慮、幻覺等異常精神癥狀，導(dǎo)致患者生活能力下降及社會(huì)參與度降低。AD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”“癲證”“郁證”等范疇，臨床上，調(diào)心方對(duì)輕度AD患者療效較好，能有效改善輕中度AD患者的認(rèn)知功能[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Morris水迷宮和海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentation，LTP）指標(biāo)的變化，觀察調(diào)心方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD雄性小鼠54只，3月齡，體質(zhì)量（25.22±1.71）g；C57BL/6J野生雄性小鼠18只，3月齡，體質(zhì)量（30.49±1.59）g，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，品系編號(hào)D000268。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

調(diào)心方（黨參2.25 g，桂枝0.42 g，石菖蒲0.83 g，遠(yuǎn)志0.38 g，龍骨0.5 g，甘草0.83 g，白芍0.5 g），配方顆粒為江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，使用前用蒸餾水充分溶解、混勻；鹽酸多奈哌齊片，5 mg/片，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20150212，使用前粉碎，用蒸餾水溶解。

1.3 主要試劑和儀器

2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、20%水合氯醛、人工腦脊液（ACSF），上海青陽(yáng)生物科技有限公司；Morris視頻分析和跟蹤系統(tǒng)（Netherlands），冰凍切片機(jī)（Thermo scientific）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和給藥

54只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為模型組、調(diào)心方組和陽(yáng)性藥組，每組18只，同時(shí)以同月齡同性別18只C57BL/6J野生小鼠為正常組。調(diào)心方組給予1.485 g/kg調(diào)心方灌胃，陽(yáng)性藥組給予0.083 mg/kg鹽酸多奈哌齊灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)12周。12周后各組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)和離體海馬電生理誘導(dǎo)。灌胃過(guò)程中死亡13只，其中模型組6只、調(diào)心方組3只、陽(yáng)性藥組2只、正常組2只，余全部進(jìn)行水迷宮行為學(xué)測(cè)試，每日均保持飲食正常。

2.2 Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)

Morris水迷宮包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：持續(xù)5 d，記錄每只小鼠60 s內(nèi)找到平臺(tái)時(shí)間。第2象限中放入一個(gè)低于水面1 cm的平臺(tái)，小鼠面向池壁從2個(gè)落水點(diǎn)（第3、4象限）以半隨機(jī)的方式放入水池中，小鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)上保持5 s后終止，記錄為逃避潛伏期，未在60 s內(nèi)找到平臺(tái)的，記錄為60 s。對(duì)未在60 s內(nèi)找到平臺(tái)的小鼠，用小木棒引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)，并讓小鼠在平臺(tái)上待30 s。小鼠從水中取出后，用毛巾將其擦干，以防小鼠受涼，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。休息10 min后，進(jìn)行另一個(gè)象限的訓(xùn)練。每日1次，每次2個(gè)象限?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：定位實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開始，為期1 d。記錄每只小鼠60 s內(nèi)第1次到達(dá)原平臺(tái)所在象限的時(shí)間和穿越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將原平臺(tái)撤掉，其余保持不變。每組小鼠從同一個(gè)入水點(diǎn)放入池中。休息10 min，再做另一個(gè)象限。

2.3 離體海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電生理記錄

2.3.1 腦片制備 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，各組隨機(jī)選取5只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，20%水合氯醛麻醉后快速斷頭，切開頭皮去除顱骨和硬腦膜，迅速取出全腦置于用95%O2和5%CO2混合氣飽和冰浴的ACSF中。切取一正方形的瓊脂塊固定于托盤上。分離左右腦半球后，置于另一預(yù)備好的氧飽和冰溫ACSF燒杯中。用腦膜剝離器分離出海馬組織。用膠水將海馬腦組織塊固定于瓊脂塊。用振動(dòng)切片機(jī)橫向切取400 μm腦片，將腦片放在孵育槽中溫室（34 ℃）30 min，然后放在室溫（25±1）℃中2～8 h，其中不斷充以混合氣，保證ACSF混處于氧飽和狀態(tài)。

2.3.2 離體海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)誘導(dǎo) 用巴斯德吸管將腦片移入記錄槽中心，置于顯微鏡下，以3 mL/min的速度持續(xù)灌流氧飽和ACSF，鏡下確定海馬CA1區(qū)。刺激電極是一個(gè)雙極電極，用突觸700 B作為刺激器，ACSF充滿玻璃吸管，電阻1～5 MΩ。將刺激電極放在shaffer纖維，記錄電極放在CA1區(qū)的輻射層。測(cè)試刺激包括單相100-μs恒電流脈沖，刺激電極每隔30 s給1個(gè)刺激（頻率0.033 Hz，波寬100-μs。通過(guò)測(cè)量興奮性突觸后電位（fEPSP）斜率來(lái)決定突觸傳遞強(qiáng)度。每給1個(gè)刺激記錄1個(gè)fEPSP，刺激強(qiáng)度由小到大，觀察記錄fEPSP幅值。此時(shí)選用fEPSP最大值的25%剌激強(qiáng)度為實(shí)驗(yàn)用刺激強(qiáng)度，記錄30 min fEPSP作為基線。然后予高頻串刺激（HFS，各50個(gè)脈沖刺激，100 Hz，間隔10 s，2串100 Hz）誘導(dǎo)LTP，高頻時(shí)刺激強(qiáng)度與基線記錄時(shí)相同，在強(qiáng)直刺激后0～60 min的平均值決定了LTP的水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，Morris水迷宮逃避潛伏期采用多組重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析。空間探索實(shí)驗(yàn)和海馬fEPSP斜率和雙脈沖（PPF）比值變化數(shù)據(jù)采用方差分析，組間比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果endprint

4.1 調(diào)心方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果：定位航行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠逃避潛伏期時(shí)間較正常組明顯延長(zhǎng)（P<0.01），與模型組比較，調(diào)心方組和陽(yáng)性藥組小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短（P<0.01），見表1。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，從第3象限入水點(diǎn)的模型組小鼠穿越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間較正常組明顯減少（P<0.01），與模型組比較，調(diào)心方組和陽(yáng)性藥組小鼠穿越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間明顯增加（P<0.05，P<0.01），見表2。在空間探索實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖中，第2象限黑點(diǎn)為原平臺(tái)所在位置。與正常組比較，模型組小鼠繞著池壁打轉(zhuǎn)，且經(jīng)過(guò)原平臺(tái)所在象限的次數(shù)減少；與模型組比較，調(diào)心方組小鼠繞著池心來(lái)回游動(dòng)，與原平臺(tái)所在的位置更近，且經(jīng)過(guò)原平臺(tái)所在象限的次數(shù)明顯增加，見圖1。

4.2 調(diào)心方對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響

用離體海馬腦片誘導(dǎo)分別記錄各組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層LTP的改變。前30 min基本刺激條件下，其基礎(chǔ)fEPSP曲線保持穩(wěn)定。各組高頻強(qiáng)直刺激后，LTP誘發(fā)成功并持續(xù)記錄60 min，在50～60 min LTP斜率趨于穩(wěn)定。在后10 min內(nèi)模型組fEPSP曲線增強(qiáng)幅度明顯低于正常組，調(diào)心方組fEPSP曲線增強(qiáng)幅度明顯高于模型組。與正常組比較，模型組小鼠fEPSP斜率明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，調(diào)心方組和陽(yáng)性藥組小鼠fEPSP斜率顯著增強(qiáng)（P<0.01），見表3。在離體腦片電生理誘導(dǎo)中測(cè)試PPF指標(biāo)，用雙脈沖比值（PPR）表示突觸反應(yīng)變化的方向和大小，PPR>1為雙脈沖易化。在刺激間隔50、100、200、250 ms時(shí)，各組小鼠PPR均無(wú)明顯差異（P>0.05），說(shuō)明各組小鼠PPF易化無(wú)明顯差異。刺激間隔250 ms時(shí)，模型組小鼠PPR與正常組比較無(wú)明顯差異（P>0.05），調(diào)心方組小鼠PPR與模型組比較無(wú)明顯差異（P>0.05），見表4。

5 討論

認(rèn)知功能包括對(duì)外在刺激的接受能力、學(xué)習(xí)與記憶能力、信息反饋處理能力、表達(dá)能力及各種心理活動(dòng)。AD患者認(rèn)知功能障礙最明顯的表現(xiàn)是記憶力減退，早期主要為近記憶減退，逐漸出現(xiàn)遠(yuǎn)記憶障礙?！端貑?wèn)·靈蘭秘典論篇》有“心者，君主之官也，神明出焉”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心為五臟六腑之大主，心氣不足，氣不生神。AD患者神情呆滯、表情淡漠、反應(yīng)遲鈍、少言懶動(dòng)等是心氣不足、痰滯瘀阻而致神明失司、機(jī)竅不利，故用調(diào)心方調(diào)心益氣、振奮心陽(yáng)、化痰開竅。調(diào)心方由黨參、桂枝、石菖蒲、遠(yuǎn)志等組成，黨參補(bǔ)元?dú)?，桂枝通血脈，石菖蒲安神，遠(yuǎn)志豁痰。

Morris水迷宮是評(píng)估動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶能力的一種重要且公認(rèn)的方法[2]。有研究報(bào)道，Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試顯示，3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同月齡正常小鼠有差異[3]。本研究Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，其逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿越原平臺(tái)次數(shù)減少及在原平臺(tái)停留時(shí)間縮短，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。通過(guò)調(diào)心方治療后，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短、穿越原平臺(tái)所在象限次數(shù)增加及在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間增加。表明訓(xùn)練后學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，進(jìn)一步證實(shí)調(diào)心方能效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的認(rèn)知能力。

神經(jīng)突觸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。LTP一直被認(rèn)為是學(xué)習(xí)與記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)之一，是研究學(xué)習(xí)記憶的理想電生理模型[4]。而海馬是神經(jīng)系統(tǒng)參與學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，大量樹突棘缺失現(xiàn)象發(fā)生在尸檢后AD患者腦內(nèi)和各種轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)[5-6]。LTP受抑制的原因是由于大量樹突棘的缺失，導(dǎo)致突觸之間的信息傳遞受到阻礙，學(xué)習(xí)記憶能力下降。研究發(fā)現(xiàn)，LTP得到改善后，其認(rèn)知和記憶功能均得到恢復(fù)[7-8]。

在離體腦片實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠在HFS前30 min內(nèi)給予刺激時(shí)未影響基礎(chǔ)fEPSP，但當(dāng)給予HFS后，模型組海馬fEPSP斜率明顯受到抑制。調(diào)心方組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬fEPSP斜率明顯增加，表明經(jīng)調(diào)心方治療能提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠LTP水平，改善其突觸可塑性，小鼠學(xué)習(xí)和記憶的功能得到改善。實(shí)驗(yàn)測(cè)試PPF的目的是用PPF改變來(lái)觀察突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變，釋放的神經(jīng)遞質(zhì)活性高，學(xué)習(xí)記憶能力也會(huì)提高。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠fEPSP斜率明顯降低，調(diào)心方組小鼠fEPSP斜率明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)調(diào)心方能有效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的LTP水平。模型組小鼠PPR與正常組比較無(wú)明顯差異，提示APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬LTP的損傷與突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放無(wú)關(guān)。

Morris水迷宮和海馬LTP記錄都是研究動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典手段，有研究發(fā)現(xiàn)二者的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有很好的一致性[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Morris水迷宮行為學(xué)結(jié)合離體場(chǎng)電位記錄，發(fā)現(xiàn)同一動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變與突觸可塑性變化的結(jié)果基本一致，表明其學(xué)習(xí)記憶能力損害程度與LTP抑制程度可能是一致的。在本研究結(jié)果中，調(diào)心方治療后，小鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)及在原平臺(tái)位置停留時(shí)間增加，從行為學(xué)角度表明調(diào)心方可有效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的認(rèn)知能力。通過(guò)調(diào)心方治療后，小鼠海馬fEPSP斜率升高，從電生理的角度闡明了調(diào)心方可改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的認(rèn)知能力。

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（收稿日期：2016-12-19）

（修回日期：2017-02-15；編輯：華強(qiáng)）endprint