左歸降糖解郁方對模擬糖尿病并發(fā)抑郁癥環(huán)境下模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白的影響

凌佳++楊琴++劉檢++王宇紅++徐雅嵐++韓遠(yuǎn)山++楊蕙++孟盼

摘要：目的 探討左歸降糖解郁方對模擬糖尿病并發(fā)抑郁癥（DD）環(huán)境下海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-8的調(diào)控作用。方法 采用受孕18 d SD大鼠胎鼠進(jìn)行海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，葡萄糖聯(lián)合皮質(zhì)酮干預(yù)構(gòu)建DD模擬環(huán)境。將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元隨機分為正常組、空白血清組、模型組、陽性藥（二甲雙胍+氟西?。┧幬镅褰M和待測藥（左歸降糖解郁方）藥物血清組，正常組和模型組給予等量培養(yǎng)液，其余組給予相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)10%藥物血清或空白血清，造模干預(yù)18 h后，Hoechst熒光染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡；高內(nèi)涵分析技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-8的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元樹突斷裂或減少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接降低，細(xì)胞存在明顯的濃染、破碎、光點分布不均現(xiàn)象，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05），Bax和Caspase-8蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和待測藥藥物血清組大鼠海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)連接顯著恢復(fù)，Hoechst熒光染色可見細(xì)胞核明顯均勻化，局部亮點明顯減少，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05，P<0.01），Bax和Caspase-8蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用可能與調(diào)控海馬神經(jīng)元Bcl-2，Bax和Caspase-8的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：左歸降糖解郁方；糖尿病并發(fā)抑郁癥；海馬神經(jīng)元；Bcl-2；Bax；Caspase-8；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.009

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0035-05

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on Hippocampus Neuron Apoptosis Related Proteins under Diabetes Mellitus with Depression States LING Jia1， YANG Qin2， LIU Jian2， WANG Yu-hong1，2， XU Ya-lan3， HAN Yuan-shan2， YANG Hui2， MENG Pan1 （1. Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 3. Changde Vocational Technical College， Changde 415003， China）

Abstract： Objective To investigate the regulating effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula （ZJJF） on Bcl-2， Bax and Caspase-8 in hippocampus neuron damage in diabetes mellitus with depression （DD）. Methods Hippocampal neurons from 18 d pregnant rats were primitively cultivated， and then combination of glucose and corticosterone was used to construct DD simulation environment. Cultivated hippocampal neurons were randomly divided into normal group， blank serum group， model group， positive medicine （metformin+fluoxetine） serum group and to-be-tested medicine （ZJJF） serum group. Normal group and model group were given same amount culture medium， while other group were given relevant amont of 10% medicine serum or blank serum. After modeling intervention for 18 h，

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81373578、81573965、81403379、81403387）

通訊作者：王宇紅，E-mail：573643177@qq.com

Hoechst staining was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons. The expression of Bcl-2， Bax and Caspase-8 was detected by high content analysis. Results Compared with the control group， hippocampal neuron dendrites ruptured or decreased， neural network connection decreased， cells showed significant staining， broken， uneven distribution of light spots， the expression of Bcl-2 protein decreased significantly （P<0.05）， but Bax and Caspase-8 were increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， hippocampal neurons in both positive medicine serum group and ZJJF serum group gradually recovered. Hoechst staining showed that the nuclei were significantly homogenized， local highlights were significantly reduced， Bcl-2 protein expression levels were significantly increased （P<0.05， P<0.01）， while Bax and Caspase-8 were obviously down-regulated （P<0.05， P<0.01）. Conclusion ZJJF has protective effects on hippocampal neurons in DD of model rats， and its mechanism is related to regulating the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-8 in hippocampus neuron.endprint

Key words： Zuogui Jiangtang Jieyu Formula； diabetes mellitus with depression； hippocampal neurons； Bcl-2； Bax； Caspase-8； rats

糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）主要表現(xiàn)特征即為認(rèn)知功能障礙。據(jù)相關(guān)研究表明，40%～50%糖尿病患者存在不同程度的抑郁癥狀[1-2]，DD是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其死亡率明顯高于單純糖尿病患者[3]。本課題組前期研究表明，DD大鼠海馬組織體積顯著減少，椎體細(xì)胞中存在不同程度的胞體深染和空泡變性，其中海馬神經(jīng)元凋亡則是海馬發(fā)生損傷的主要原因[4-5]。因此，本研究擬從體外角度輔以高內(nèi)涵分析技術(shù)（HCA），檢測大鼠模擬DD環(huán)境下海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2、Bax和Caspase-8等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并初步探討左歸降糖解郁方對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD雌性大鼠（受孕18 d）3只，體質(zhì)量350～450 g，SPF級SD雄性大鼠9只，體質(zhì)量200～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。其中雌性大鼠直接用于海馬神經(jīng)元原代取材，雄性大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（黃芪、熟地黃、枸杞子、山萸肉、丹參、姜黃、菟絲子、杜仲、牛膝、牡丹皮、貫葉連翹），飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并由該院制劑科按一定比例水煎濃縮后制成口服液；鹽酸二甲雙胍片，湖南湘雅制藥有限公司，批號1402115；鹽酸氟西汀膠囊，法國Patheon，批號2087A。

1.3 主要試劑與儀器

皮質(zhì)酮、L-多聚賴氨酸、DMSO（美國Sigma），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（美國Amresco），D-葡萄糖、DMEM/F12、胎牛血清（美國Hyclone），Neurobassal神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基、B27添加劑、Glutamax（美國Gibco），多聚甲醛（中國科密歐），兔抗烯醇化酶多克隆抗體（（NSE，中國Bioworld），Hoechst 33258（中國Beyotime），兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Caspase-8單克隆抗體、小鼠抗β-tublin多克隆抗體（美國Proyeintech），DAPI、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、R-PE標(biāo)記羊抗小鼠IgG（英國Abcam）。CO48R-230型三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（NEW BRUNSWICK GALAXY），OPERETTA型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（PerkinElmer），S8PAO型體視顯微鏡（LEICA）。

2 實驗方法

2.1 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)及鑒定

將受孕18 d SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取胎鼠全腦，解剖鏡下夾取海馬，并剝凈殘余腦膜及血管，剪碎后加1∶1的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化、離心、重懸、計數(shù)，接種于預(yù)先包被L-多聚賴氨酸的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（6×104/孔），置于培養(yǎng)箱中4 h后全量換成維持液（Neurobassal神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基∶B27添加劑∶Glutamax∶雙抗=96∶2∶1∶1），第3日半量更換維持液。待神經(jīng)元生長至第5日，用預(yù)冷PBS洗3次×5 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，清洗后加0.25%Triton X-100溶液作用15 min，再加5%BSA封閉30 min，清洗，滴加兔NSE和小鼠抗大鼠β-tublin相關(guān)抗原抗體（1∶100），4 ℃濕盒過夜，清洗，加FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，清洗，加細(xì)胞核染色劑DAPI室溫孵育20 min，清洗，最后每孔加入50 μL PBS，用HCA系統(tǒng)觀察分析。

2.2 藥物血清制備

將SPF級雄性SD大鼠隨機分為待測藥藥物血清組、陽性藥藥物血清組和空白血清組，每組3只。根據(jù)前期動物實驗[6]，分別對應(yīng)給予臨床有效3倍量的左歸降糖解郁方（32.8 g/kg）、氟西汀+二甲雙胍（1.8 mg/kg，0.18 g/kg）、蒸餾水，2次/d，連續(xù)3 d。末次給藥后，無菌條件下腹主動脈取血并暫存于促凝管中，靜置2 h后，3000 r/min離心15 min，吸取上清液，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾，分裝后于-80 ℃超低溫冰箱存放備用。

2.3 造模、分組和給藥

待神經(jīng)元生長至5～7 d，參照文獻(xiàn)方法[7-8]加入高糖（150 mmol/L）和皮質(zhì)酮（200 μmol/L），干預(yù)18 h，構(gòu)建模擬DD損傷環(huán)境的海馬神經(jīng)元體外模型。將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元隨機分為正常組、空白血清組、模型組、陽性藥藥物血清組和待測藥藥物血清組，并分別加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)10%的藥物血清及空白血清，正常組和模型組則給予等量培養(yǎng)液。

2.4 Hoechst熒光染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡

上述各組神經(jīng)元經(jīng)造模和干預(yù)18 h后，棄原有上清液，用預(yù)冷PBS清洗2 min×3次，再經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，0.25%TritonX-100作用15 min，每孔加100 μL Hoechst 33258室溫避光環(huán)境孵育20 min。以上各操作之間均用預(yù)冷PBS清洗5 min×3次，最終向每孔內(nèi)加50 μL PBS以維持觀察環(huán)境，采用HCA法進(jìn)行檢測。

2.5 高內(nèi)涵分析技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-8的表達(dá)

神經(jīng)元經(jīng)造模和干預(yù)18 h后，固定、打孔，每孔加5%BSA封閉30 min，加一抗稀釋液孵育1 h，加FITC或RP-E標(biāo)記的二抗稀釋液孵育30 min，加核染劑DAPI稀釋液孵育20 min，孵育過程均室溫避光進(jìn)行。最終向每孔補加PBS維持觀察環(huán)境，上機檢測。endprint

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，當(dāng)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性且組間方差齊時，采用方差分析；如不滿足上述條件，則采用非參數(shù)檢驗法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 海馬原代神經(jīng)元的一般形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

培養(yǎng)5～7 d后，倒置顯微鏡下直接觀察發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元胞體圓潤透亮，光澤度及折光性好，突起縱橫交錯，細(xì)小分支眾多，相互連接形成均勻的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。NSE是神經(jīng)元胞漿內(nèi)的一種可溶性酸性蛋白，為神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物。HCA檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE染色后，可見綠色熒光在胞漿中呈陽性表達(dá)，隨機選取10個視野，計算其呈陽性細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果表明陽性細(xì)胞率達(dá)95%以上，見圖1。

4.2 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

從HCA結(jié)果可知，隨機選取10個視野，正常組、空白血清組、模型組、陽性藥藥物血清組和待測藥藥物血清組中呈凋亡狀態(tài)細(xì)胞比例分別為12.6%、15.1%、54.9%、35.1%和41.7%，其中正常組細(xì)胞發(fā)出的藍(lán)色熒光分布均勻，光團(tuán)完整均一，無明顯凋亡特征；相比之下，模型組細(xì)胞光團(tuán)分散，熒光分布不均，呈顆粒狀分布，局部出現(xiàn)濃染，提示模型組神經(jīng)元出現(xiàn)大量凋亡；經(jīng)陽性藥或待測藥藥物血清作用后，熒光分布均勻化，顆粒狀光點明顯減少。結(jié)果見圖2。

4.3 左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

HCA檢測結(jié)果顯示，與正常組及空白血清組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元之間樹突斷裂或減少，網(wǎng)絡(luò)連接明顯減少，神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2蛋白平均熒光強度顯著降低（P<0.05），而蛋白Bax和Caspase-8的對應(yīng)熒光強度明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，待測藥藥物血清組和陽性藥藥物血清組樹突連接及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)斷裂情況得到明顯修復(fù)，大鼠神經(jīng)元Bcl-2蛋白平均熒光強度明顯升高（P<0.05，P<0.01），Bax平均熒光強度降低，Caspase-8蛋白平均熒光強度明顯降低（P<0.01），熒光強度與對應(yīng)蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)果見圖3～圖5。

5 討論

HCA是一種新型篩選技術(shù)，可在保證細(xì)胞完整的前提下，借助高分辨率熒光數(shù)碼成像系統(tǒng)對待測樣品的形態(tài)變化和生物分子表達(dá)進(jìn)行檢測，其主要特點是可通過單次檢測獲取大量靶點數(shù)據(jù)以實現(xiàn)高通量篩選，目前主要應(yīng)用于藥物初篩、作用靶點研究及安全性評價等方面[9]。HCA以熒光標(biāo)記的待測細(xì)胞為主要模型，通過觀察受試細(xì)胞中綠色熒光蛋白-靶點（標(biāo)志性信號分子）融合蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)位變化，從而分析受試分子對特定靶點或通路的影響[10]。本研究采用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核以實現(xiàn)細(xì)胞定位，采用RP-E標(biāo)記細(xì)胞骨架β-actin蛋白（橙黃色熒光）以觀察神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)變化，采用FITC標(biāo)記其他目標(biāo)靶蛋白（綠色熒光）以檢測各靶蛋白在各干預(yù)條件下的表達(dá)趨勢。

海馬組織是DD發(fā)生的關(guān)鍵靶器官，其神經(jīng)元受損是其主要表現(xiàn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可引起2型糖尿病大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂，海馬、下丘腦、垂體和腎上腺等器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的器質(zhì)性病變，表現(xiàn)為海馬椎體細(xì)胞中存在不同程度的胞體深染和空泡變性，表明DD狀態(tài)下海馬神經(jīng)元存在凋亡現(xiàn)象[11-12]，然而其內(nèi)在的分子機制并未得到深入探究。本實驗通過采用高糖聯(lián)合皮質(zhì)酮復(fù)制DD體外模型，Hoechst 33258染色結(jié)果表明，DD的發(fā)生可引起大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生需要啟動細(xì)胞內(nèi)多種基因調(diào)控和蛋白表達(dá)，其中Bcl-2家族與Caspase家族相關(guān)蛋白及基因是主要參與因子。Bcl-2家族中成員眾多，主要包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Bcl-2蛋白是Bcl-2基因的編碼產(chǎn)物，屬于一種抗凋亡蛋白，主要存在于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，通過穩(wěn)定線粒體膜防止線粒體內(nèi)促凋亡相關(guān)蛋白泄漏，同時可阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放，使依賴Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低等途徑阻斷細(xì)胞凋亡；而Bax蛋白是Bcl-2的同源水溶性相關(guān)蛋白，主要分布在胞質(zhì)中，其功能與Bcl-2相反，可通過與Bcl-2形成異源二聚體而拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)，屬于一種促凋亡蛋白。因此，Bcl-2/Bax是衡量細(xì)胞是否會發(fā)生凋亡的重要指標(biāo)。Caspase是凋亡過程中的公認(rèn)主要相關(guān)基因，其中Caspase-8是Caspase級聯(lián)反應(yīng)的核心啟動因子，其激活后可激活所有凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)的發(fā)生，其編碼產(chǎn)物屬于凋亡相關(guān)蛋白。

本項研究顯示，陽性藥和待測藥藥物血清組均可明顯抑制海馬神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接恢復(fù)；經(jīng)高糖聯(lián)合皮質(zhì)酮處理后，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的平均熒光強度明顯減弱，促凋亡相關(guān)蛋白Bax與Caspase-8的平均熒光強度明顯增強，即Bcl-2呈低表達(dá)，Bax與Caspase-8呈高表達(dá)，經(jīng)左歸降糖解郁方藥物血清干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax與Caspase-8的表達(dá)均呈下降趨勢。提示左歸降糖解郁方可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax與Caspase-8的表達(dá)，對抗高糖與皮質(zhì)酮的聯(lián)合損傷作用，使海馬神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象被顯著改善。課題組前期體內(nèi)實驗研究也發(fā)現(xiàn)，DD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，JNK、Bax蛋白及基因表達(dá)明顯上升，Bcl-2表達(dá)下降，最終導(dǎo)致海馬損傷、學(xué)習(xí)記憶功能障礙和抑郁發(fā)生，而左歸降糖解郁方可通過抑制JNK表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl與Bax之間的平衡關(guān)系而抑制海馬神經(jīng)元凋亡[6]，這提示體內(nèi)與體外實驗結(jié)果相對一致，同時亦佐證了左歸降糖解郁方對學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用。

綜上所述，左歸降糖解郁方可改善DD的海馬功能，其可通過線粒體Bax/Bcl-2/Caspase-8途徑減少海馬神經(jīng)元的凋亡而發(fā)揮作用，通過有效調(diào)控神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白可能是左歸降糖解郁方治療DD的重要機制之一，但其抗細(xì)胞凋亡的具體機制仍有待進(jìn)一步研究。endprint

參考文獻(xiàn)：

[1] MUT-VITCU G， TIMAR B， TIMAR R， et al. Depression influences the quality of diabetes-related self-management activities in elderly patients with type 2 diabetes：a cross-sectional study[J]. Clinical Interventions in Aging，2016，11：471.

[2] 趙洪影，王瑞瑞，吳恩杰，等.1型糖尿病患兒抑郁癥的患病率調(diào)查及兩病相關(guān)性研究[J].中國婦幼保健，2016，31（13）：2658-2660.

[3] VAN DOOREN F E， NEFS G， SCHRAM M， et al. Depression and risk of mortality in people with diabetes mellitus：a systematic review and meta-analysis[J]. PLos One，2013，8（3）：e57058.

[4] 楊蕙，王宇紅，張秀麗，等.慢性應(yīng)激對2型糖尿病大鼠HPA軸紊亂及海馬損傷的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（11）：2660-2663.

[5] WANG Y H， HUI Y， WEI L， et al. Zuogui Jiangtang Jieyu Formulation prevents hyperglycaemia and depressive-like behaviour in rats by reducing the glucocorticoid Level in plasma and hippocampus[J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2015， 2015：158361.

[6] 孟盼，趙洪慶，杜青，等.左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（9）：78-81.

[7] 劉檢，王宇紅，徐雅嵐，等.改良的胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)及模擬糖尿病并發(fā)抑郁環(huán)境對其的損傷作用[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2016，32（4）：459-465.

[8] 張秀麗，王宇紅，楊蕙，等.左歸降糖解郁方對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，34（12）：8-12.

[9] MOUCHET E H， SIMPSON P B. High-content assays in oncology drug discovery：opportunities and challenges[J]. Idrugs，2008，11（6）：422-427.

[10] 馮帆，龍隆，李微，等.應(yīng)用高內(nèi)涵分析技術(shù)識別雄激素受體激動劑[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28（1）：42-50.

[11] 楊蕙.糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型的建立及中藥干預(yù)作用[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[12] 張秀麗，王宇紅，楊蕙，等.左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（4）：787-789.

（收稿日期：2017-01-13）

（修回日期：2017-02-05；編輯：華強）endprint