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    UL27、UL29 基因shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建及對HSV-2 的干擾效應(yīng)研究

    2014-01-14 04:39:52呂延成潘曉瑜黃暢丁娟
    生物技術(shù)通報 2014年5期
    關(guān)鍵詞:滴度存活率質(zhì)粒

    呂延成 潘曉瑜 黃暢 丁娟

    (遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生化與分子細(xì)胞生物學(xué)教研室,珠海 519040)

    Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)是生殖器皰疹(GH)的主要病原體。HSV-2 一旦感染將終身潛伏在骶神經(jīng)節(jié)[1,2]。近年來的研究認(rèn)為,Ⅱ型單純皰疹病毒感染和艾滋?。?]、宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)性[4-7],國內(nèi)外研究顯示HSV-2 患病率呈不斷上升趨勢[8]。目前治療生殖器皰疹主要使用廣譜抗病毒藥物,治療的目的主要是緩解癥狀,縮短病程,減輕疼痛及防止繼發(fā)感染等[9,10]。同時隨著各種激素的大量使用,HSV-2病毒耐藥性有逐漸增加的趨勢[11,12]。因此,尋找新的抗病毒治療策略,研制新型抗病毒藥物已成為當(dāng)今HSV-2 感染后治療的研究熱點(diǎn)。

    RNA 干擾(RNA interference,RNAi)能夠使mRNA 發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默,是一種新型的基因阻斷技術(shù),能高效、特異的抑制基因表達(dá)。運(yùn)用RNAi 干擾技術(shù)抑制病毒增殖和感染是當(dāng)前抗病毒研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[13-16],目前國內(nèi)外運(yùn)用RNAi 技術(shù),特別是聯(lián)合干擾對HSV-2 的研究報道較少。

    HSV-2 是生殖器皰疹的主要病原體,UL27、UL29 都在病毒感染過程中起重要作用,因此以UL27 基因、UL29 基因為靶點(diǎn)的治療具有廣闊前景。HSV-2 UL27 基因編碼的gB 蛋白是在感染細(xì)胞中含量最多的糖蛋白,gB 的胞漿區(qū)是12 個包膜糖蛋白中最長的,提示它在感染過程中起重要作用。gB 以寡聚體形式存在于病毒包膜上,并與細(xì)胞膜上氨基聚糖硫酸乙酰肝素或硫酸軟骨素結(jié)合,使病毒吸附于宿主細(xì)胞膜上,介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合、病毒穿入和胞間擴(kuò)散,引發(fā)病毒循環(huán)復(fù)制過程。gB 是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo),也是HSV-2特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的主要靶標(biāo)。gB 表達(dá)缺失必定影響病毒吸附和穿入細(xì)胞,從而抑制HSV-2的感染。UL29 基因編碼合成的ICP8 蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白,調(diào)控病毒DNA 復(fù)制和γ 基因的表達(dá)。研究表明,該蛋白是病毒復(fù)制所必須的,一旦發(fā)生突變則可影響晚期基因的表達(dá)和DNA 的合成。該蛋白主要作用是結(jié)合病毒RNA 從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì),抑制pre-mRNA 的剪切等。

    本研究利用RNA 干擾技術(shù),針對HSV-2 UL27、UL29 基因分別設(shè)計、合成8 對寡核苷酸,采用基因重組技術(shù)構(gòu)建shRNA 表達(dá)載體,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后表達(dá)siRNA,再接種HSV-2。通過實時熒光定量PCR 法檢測UL27、UL29 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平,分析shRNA 表達(dá)載體對UL27 和UL29 基因的抑制效果。篩選出干擾效率高的表達(dá)載體,進(jìn)行聯(lián)合干擾試驗,用終點(diǎn)滴定法檢測干擾后的子代病毒滴度;用MTT 法檢測細(xì)胞的存活率;用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測目的基因蛋白表達(dá)水平。旨在為進(jìn)一步研究通過RNAi 手段抑制HSV-2 的關(guān)鍵基因的表達(dá)治療HSV-2 提供試驗依據(jù)和理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    HEK293 細(xì) 胞、大 腸 桿 菌DH5α 由 遵 義 醫(yī) 學(xué)院珠海校區(qū)中心實驗室提供;HSV-2 333 標(biāo)準(zhǔn)株來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC);質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo 全長5 117 bp,購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶BamH I、Bbs I、Pst I 購自美國Fermentas,T4 DNA 連接酶購自杭州碧云天生物技術(shù)研究所,RNA 提取試劑RNAisoTMPlus、SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit 購自寶生物工程(中國大連)有限公司,DMEM 培養(yǎng)基購自美國GIBCO,新生牛血清購自杭州四季青公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 購自Invitrogen 公司,鼠抗gB、ICP8 單抗購自美國Santa cruz 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建 從GenBank 上獲得HSV-2(NC_001798)UL27 和UL29 基因序列,利用Invitrongen 公司的shRNA 在線設(shè)計軟件,進(jìn)行靶序列的初篩。用Blast 檢索將初篩的靶序列與其他人類基因組進(jìn)行比對,通過RNA structure 5.0 軟件對靶mRNA 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析,篩選出4 條特異性序列作為靶序列,同時在試驗中設(shè)計不針對任何基因的序列為陰性對照(Negative control,NC),見表1。

    表1 篩選的HSV-2UL27、UL29 靶序列

    表1 中 DNA 序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成,將寡核苷酸鏈退火形成shRNA 模板雙鏈,通過T4 連接酶連接到pGPU6/GFP/Neo 上,形成pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達(dá)重組載體,轉(zhuǎn)化后挑取單菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,用Pst I、BamH I進(jìn)行酶切鑒定。

    1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293 細(xì)胞 HEK293 細(xì)胞在10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中,37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HEK293 細(xì)胞以4×104-5×104個/孔接種于24 孔板,待細(xì)胞豐度到80%時,用100 μL 質(zhì)粒/lipofectamin2000 復(fù)合物加到含有細(xì)胞24 孔培養(yǎng)板的孔中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后;試驗分為4 組:空白組(空載體)、陰性對照組(shRNA NC)、對照組(shRNAGAPDH)、各干擾組,每組設(shè)3 個復(fù)孔,分別于12、24、36 和48 h 在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 表達(dá)情況,收集細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測,計算含有熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

    轉(zhuǎn)染效率(%)=熒光細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%

    1.2.3 HSV-2 感染HEK293 細(xì)胞 HSV-2 接種HEK-293 細(xì)胞,用2%病毒維持液培養(yǎng)病毒,反復(fù)凍融法收獲子代病毒。采用終點(diǎn)滴定法測定病毒滴度。按Reed-Muench 法計算,能引起50%細(xì)胞發(fā)生病變的病毒最高稀釋度(50% tissue culture infective dose,TCID50),即病毒滴度。各試驗組在37℃,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后,再接種TCID50病毒。1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測UL27 基因的轉(zhuǎn)錄水平 病毒感染48 h 后,抽提細(xì)胞總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用實時定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,用SYBRGreen I 檢測。以GAPDH 作為內(nèi)參檢測各組細(xì)胞內(nèi)mRNA 表達(dá)水平,引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:內(nèi)參GAPDH 上游引物:5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3',下游引物:5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3';UL27 上游引物:5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3',下游引物:5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'。反應(yīng)條件:95℃ 5 min;95℃ 20 s,62℃ 30 s,70℃ 30 s,共40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,以每孔GAPDH 的定量作為標(biāo)準(zhǔn),分別校正各孔UL27 基因表達(dá)的差異,各組表達(dá)量采用2-△△Ct計算。

    1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種HSV-2 48 h 后,收集細(xì)胞,提取蛋白。采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳分離,通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。后者在含5%脫脂奶粉的PBST 中37℃封閉90 min,加入一抗4℃孵育過夜;PBST 充分漂洗(10 min×3 次),加入二抗37℃作用40 min;PBST 充分漂洗(10 min×3 次);化學(xué)熒光法(ECL)顯色,以GADPH 蛋白為內(nèi)參照,曝光獲取圖像,比較各組蛋白表達(dá)量。

    1.2.6 子代病毒滴定及MTT 法測定293 細(xì)胞存活率 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 并感染病毒后,使用終點(diǎn)滴定法,對上述收集的子代病毒液進(jìn)行病毒滴度測定,采用MTT 法,對細(xì)胞的存活率進(jìn)行測定。

    1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩組間比較采用LSD 檢驗。P<0.05 表示顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA酶切鑒定結(jié)果

    shRNA 模板成功插入到質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo 上時,原質(zhì)粒上的Pst I 酶切位點(diǎn)被置換消失。如果構(gòu)建成功,則pGPU6/GFP/Neo-shRNA 可以被BamH I切開,而不能被Pst I 切開。Pst I 酶切結(jié)果顯示有兩條帶,分別為超螺旋的SC 構(gòu)型和質(zhì)粒的松弛開環(huán)OC 構(gòu)型,這兩條帶可以證明重組質(zhì)粒不能被Pst I 酶切。重組體被BamH I 單酶切而線性化,條帶在5 100 bp 左右(圖1)。

    圖1 重組質(zhì)粒的Pst Ⅰ和BamH Ⅰ酶切電泳圖譜

    2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測定

    pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后,GFP 的表達(dá)達(dá)到高峰。流式細(xì)胞儀測得轉(zhuǎn)染后12、24 和48 h 含有熒光的細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)的百分比分別為22.5%、37.5%和80%(圖2,圖3)??梢娹D(zhuǎn)染48 h 后,轉(zhuǎn)染效率最好。

    圖2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 圖像(100×)

    2.3 HSV-2病毒滴度測定

    通過終點(diǎn)滴定法測定HSV-2 病毒TCID50,以確定感染細(xì)胞所需的病毒量。計算結(jié)果顯示,TCID50為10-3.5/100 μL。表2 顯示,能使50%細(xì)胞出現(xiàn)病變的稀釋度在10-3與10-4之間。

    圖3 流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率

    表2 HSV-2 病毒滴度滴定結(jié)果

    2.4 HEK293細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

    各組shRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并感染HSV-2 48 h 后,以正常細(xì)胞空白組、陰性對照組(shRNA NC)為參照,觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果(圖4)顯示,接種24 h 后,可見陰性組多數(shù)細(xì)胞融合為多核巨細(xì)胞。接種48 h后,大部分細(xì)胞脫落,多核巨細(xì)胞裂解為細(xì)胞碎片。以正常細(xì)胞為對照,干擾組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)。

    圖4 各組HEK293 細(xì)胞的CPE(100×)

    2.5 shRNA表達(dá)載體對UL27、UL29mRNA各組的抑制效果

    接種HSV-2 48 h 后,用熒光定量PCR 法檢測各組細(xì)胞內(nèi)HSV-2 mRNA 的表達(dá)量。圖5 顯示在單干擾組中UL27 shRNA75 對UL27mRNA 的抑制率最高,為75.17%,UL29 shRNA1461 對UL29mRNA 的抑制率最高,為66.08%。

    2.6 UL27、UL29聯(lián)合干擾表達(dá)載體對mRNA的抑制效果

    聯(lián)合干擾組接種HSV-2 48 h 后,實時熒光定量PCR 法檢測各組細(xì)胞mRNA。結(jié)果(表3)顯示,UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯(lián)合組對UL27 基因表達(dá)的CT 值為30.16±0.11,對UL29 基因表達(dá)的CT 值為28.72±0.24,聯(lián)合干擾組與空白對照組比較具有顯著性差異(P<0.05);而陰性對照組與空白對照組相比,無顯著性差異(P>0.05)。

    圖5 shRNA 表達(dá)載體對UL27、UL29mRNA 的抑制效率

    表3 shRNA 聯(lián)合表達(dá)載體對mRNA 的抑制效果

    2.7 終點(diǎn)滴定法測定子代病毒滴度

    HEK293 各組細(xì)胞接種HSV-2 48 h 后,收集子代病毒液進(jìn)行病毒滴度測定,病毒滴度用TCID50計算。與空白對照組、陰性對照組比較,干擾組(UL29 shRNA939 和UL29 shRNA1653)病毒滴度有下降,但未有顯著性差異(P>0.05);其余各干擾組病毒滴度均有不同程度下降,有極顯著性差異(P<0.01)。

    表4 轉(zhuǎn)染后各組的病毒滴度測定

    2.8 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體對HSV-2蛋白表達(dá)效果的影響

    各轉(zhuǎn)染組接種病毒48 h 后,分別收集細(xì)胞提取蛋白,然后經(jīng)電泳,轉(zhuǎn)印后,加入gB 抗體和ICP8 抗體對目的蛋白進(jìn)行檢測,其中UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯(lián)合干擾組與單干擾組相比,蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)(圖6)。

    2.9 MTT法檢測293細(xì)胞存活率

    各轉(zhuǎn)染組接種病毒48 h 后,棄上清加入10 μL MTT 溶液(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h,然后每孔加入100 μL DMSO,振蕩10 min,酶標(biāo)儀下讀取吸光度,計算細(xì)胞存活率。結(jié)果(圖7)顯示,聯(lián)合干擾組UL27 shRNA75+ UL29 shRNA1461 的細(xì)胞存活率最高。

    3 討論

    近年來,對RNAi 的研究現(xiàn)狀分析,在哺乳類動物中,RNAi 并不能完全阻斷基因的表達(dá),對阻斷基因的mRNA 水平表達(dá)量有一定的限度[17],siRNA 在 細(xì) 胞 內(nèi) 與RISCs(RNA-induced silencing complexes)結(jié)合后,通過其識別并沉默相應(yīng)的mRNA,RISCs 有一定的飽和度,過多的siRNA 反而可能抑制其活性,也不可能無限增大siRNA 的濃度。因此將兩種基因或者多個基因的分子靶向治療相結(jié)合正成為日益活躍的研究領(lǐng)域。其原因有:其一,由于病毒感染是一個多因素、多階段、多基因參與的復(fù)雜過程,病毒對不同的基因治療的敏感性有差異,單一的基因治療往往不能取得良好的療效,隨著病毒的突變,可能在一定程度上抵消其作用,聯(lián)合基因治療有望提高療效。其二,采取不同的治療途徑,利用各個基因治療的優(yōu)點(diǎn),提高治療效果,降低對機(jī)體正常組織的副作用。

    因此本試驗針對HSV-2 UL27 和UL29 基因各篩選出的4 條靶序列構(gòu)建特異性shRNA 質(zhì)粒表達(dá)載體,在體外細(xì)胞水平上觀察研究RNAi 對HSV-2 的抑制效應(yīng)以及二者聯(lián)合干擾對HSV-2 的抑制效應(yīng)。試驗中UL27、UL29 各篩選出的4 條靶序列的沉默效果各有差異,其中在mRNA 水平上的單干擾組中UL27 shRNA75 組對UL27 基因mRNA 的抑制率為75.17%,UL29 shRNA1461 組對UL29 基因mRNA 抑制率為66.08%,UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461聯(lián)合干擾組對UL27 基因抑制率約為91.28%,UL29基因表達(dá)抑制率約為80.40%,并用Western blotting 技術(shù)在蛋白水平上得到驗證。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步從子代的病毒滴度的變化、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞的存活率等方面檢測pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重組表達(dá)載體對HSV-2 復(fù)制的影響。經(jīng)空白對照組和陰性對照組及各單干擾組的比較說明,UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 聯(lián)合干擾組的子代病毒滴度最低,細(xì)胞的存活率也更高,說明其能更好地抑制HSV-2 的復(fù)制。

    由此可見,HSV-2 UL27 基因在病毒感染階段起關(guān)鍵作用,而UL29 基因都在病毒復(fù)制過程中起重要作用,因此聯(lián)合干擾二者的合成,對阻止HSV-2病毒吸附和穿入以及干擾病毒DNA 合成復(fù)制,從而抑制HSV-2 病毒的感染與復(fù)制。本試驗結(jié)果表明聯(lián)合靶向干擾效果優(yōu)于各自的單個干擾,顯示兩個基因之間具有相互協(xié)同效應(yīng),能夠相互聯(lián)合增強(qiáng)對單一基因的抑制。HSV-2 復(fù)制循環(huán)包括吸附、穿入、脫衣殼、DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、核衣殼組裝和病毒釋放等順序過程。可能缺失了gB 的病毒就喪失了感染的能力,導(dǎo)致之后整體的HSV-2的DNA 復(fù)制就下降了?;诨蛑g的相互聯(lián)系和作用,導(dǎo)致相應(yīng)的單鏈DNA 結(jié)合蛋白也會減少,從而進(jìn)一步抑制HSV-2 DNA 的復(fù)制。提示聯(lián)合靶向特異性shRNA可能從不同途徑阻止HSV-2感染和復(fù)制,還可能減少shRNA 抗病毒感染過程中出現(xiàn)病毒變異株的概率。

    圖6 Westernblot 檢測gB 和ICP8 蛋白的表達(dá)結(jié)果

    圖7 MTT 法測定293 細(xì)胞存活率

    HSV-2 在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖由多種病毒蛋白和宿主蛋白之間的協(xié)同作用所決定,因此可以進(jìn)一步研究針對不同的病毒關(guān)鍵基因,如ICP4、UL54、US3 等進(jìn)行多個靶點(diǎn)shRNA 的設(shè)計,亦可將UL27 和UL29 的特異性siRNA 構(gòu)建于同一個shRNA重組表達(dá)載體,或者同一基因的兩個特異性siRNA構(gòu)建于同一個表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞,這些方法可能會產(chǎn)生更高效的抑制作用。

    4 結(jié)論

    本研究成功構(gòu)建并篩選了有效抑制病毒復(fù)制的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重 組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞,可以降低子代的病毒滴度、抑制UL27、UL29 基因的mRNA 和蛋白的表達(dá),提高細(xì)胞的存活率。

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