細胞膜通透性的調(diào)節(jié)對木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的影響

湯衛(wèi)華賈士儒

（1天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，天津300350） （2天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457）

細胞膜通透性的調(diào)節(jié)對木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的影響

湯衛(wèi)華1*賈士儒2

（1天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，天津300350） （2天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457）

細菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是一些細菌的初級代謝產(chǎn)物，主要起到保護層的作用。BC在化學結(jié)構(gòu)上與植物纖維是相同的，但其極為精致的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)賦予了BC更多的性能。因此BC在醫(yī)用材料、造紙、紡織以及食品等領域中有廣泛的應用。近幾年來，BC已成為研究的熱點，但由于成本高、產(chǎn)量低、技術(shù)轉(zhuǎn)化脫節(jié)等問題，使BC難以實現(xiàn)規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。

人為改變細胞膜的通透性，可以改變原料的輸入或代謝產(chǎn)物的排出速率，同時也可能對細胞造成損傷，這是實現(xiàn)代謝人工調(diào)控的重要方法之一。在微生物代謝中，改變細胞膜通透性是有效生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的一種常用方法。BC的生物合成是一個極其復雜的生化過程，受到諸多因素的影響，細胞膜通透性就是其影響因素之一。目前僅有鄧毛程等人在這方面進行了初步探討。本文采用化學法（添加表面活性劑和有機溶劑）和物理法（超聲波），綜合研究細胞膜通透性的調(diào)節(jié)對木醋桿菌產(chǎn)BC的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

M12木醋桿菌（Acetobacter xylinum），天津市工業(yè)微生物重點實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基的配制：取胰蛋白胨5 g，酵母粉5 g，檸檬酸1 g，葡萄糖20 g，Na2HPO45 g，加蒸餾水1000mL，加熱溶解，調(diào)整pH為6.0，121℃滅菌20min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將1～2環(huán)斜面種子接入裝有50mL～100mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃下160 r/min培養(yǎng) 24 h～30 h。

1.3.2 液體培養(yǎng)

以體積分數(shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)6 d。

1.4 分析方法

1.4.1 BC的提取和處理方法

培養(yǎng)結(jié)束后將膜取出，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測pH值，約7.2。80℃干燥至恒重，進行稱重。纖維素的產(chǎn)量表示為：g纖維素/L培養(yǎng)基。

1.4.2 菌體量的測定

用0.85%的生理鹽水配制pH為4.6～4.8的0.1 mol/L的醋酸鉀－醋酸緩沖溶液100mL，取纖維素酶2 g放入緩沖溶液中活化，置冰箱備用。測定時，每次取活化好的纖維素酶溶液2mL在50℃、pH 5.0條件下充分水解2 h，適當稀釋后，于600nm波長下測吸光值（OD600nm值）。

2 結(jié)果與討論

2.1 吐溫-80添加量對BC產(chǎn)量的影響

以體積分數(shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后，在液體培養(yǎng)基中分別添加1%、2%、4%、6%、8%的吐溫-80（已滅菌），研究吐溫-80添加量對木醋桿菌BC產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 吐溫-80添加量對BC產(chǎn)量和菌體生長的影響

由圖1可知，吐溫-80對BC的生物合成具有明顯的促進作用。隨著吐溫-80添加量提高，BC產(chǎn)量隨之提高；當添加量提高至4%時，細菌纖維素的產(chǎn)量達5.9 g/L，是對照組的1.23倍。吐溫-80添加量進一步提高至6%和8%，BC的產(chǎn)量開始下降。同時研究發(fā)現(xiàn)，吐溫-80對木醋桿菌的生長沒有促進作用，當吐溫-80的添加量小于4%時，木醋桿菌的生長受到輕微的抑制作用；而添加量增至6%時，木醋桿菌的生長受到明顯的抑制，其菌體量僅為對照組的72.3%，同時BC產(chǎn)量開始下降。一般來講，木醋桿菌生長的同時伴隨著BC的分泌，而這個結(jié)果與該結(jié)論不符。有研究認為BC的超細網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可以保護木醋桿菌不受外界環(huán)境如高溫、干燥、紫外線燈等惡劣條件的影響，原因可能是木醋桿菌受到外界不利環(huán)境的刺激后，會加快合成細菌纖維素來進行自我保護。該試驗結(jié)果與鄧毛程等人的研究結(jié)果相似。

2.2 有機溶劑對BC產(chǎn)量的影響

有機溶劑會溶解在細胞膜內(nèi)，破壞細胞膜的完整性，影響細胞膜作為屏障和能量轉(zhuǎn)換功能。以體積分數(shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后，在液體培養(yǎng)基中分別添加不同量的丙酮、氯仿和甲苯，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，研究有機溶劑的種類及添加量對木醋桿菌BC產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 有機溶劑對BC產(chǎn)量和菌體生長的影響

圖2的結(jié)果表明，有機溶劑對BC的生物合成無明顯的促進作用。當丙酮添加量為0.5%時，BC產(chǎn)量達到5.42 g/L，是對照組的1.03倍，而進一步提高丙酮的添加量，BC產(chǎn)量下降。當氯仿和甲苯的添加量為0.5%時，木醋桿菌的生長和BC的生物合成均有微量的提高。但是當兩者的添加量繼續(xù)提高，菌體生長和BC合成均受到明顯的抑制。當氯仿和甲苯的添加量分別達到3.0%和1.5%時，菌體量和BC產(chǎn)量均降至0。

這幾種有機溶劑中，氯仿和甲苯是一種對細胞生長有毒害作用的有機溶劑，雖然在低濃度情況下，木醋桿菌對有機溶劑有一定的耐受性，但是濃度提高后，超過菌體的耐受性，其會對菌體產(chǎn)生毒害作用，導致菌體大量死亡。

2.3 超聲波對BC產(chǎn)量的影響

超聲波的空化作用和機械作用可增加細胞膜的通透性，使細胞膜發(fā)生可以修復的損傷，從而使細胞內(nèi)的物質(zhì)釋放到細胞外。以體積分數(shù)6%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后，在一定超聲功率、頻率條件下，分別處理30 s、60 s、90 s、120 s，繼續(xù)培養(yǎng)3 d?？疾斐暡▽δ敬讞U菌生物合成BC的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同超聲時間對BC產(chǎn)量的影響

由圖3可知，超聲波對木醋桿菌生物合成BC具有輕微的促進作用。菌體生長1 d后，采用超聲處理時間為60 s時，BC的產(chǎn)量達到6.31 g/L，是對照組的1.08倍。繼續(xù)增加超聲處理時間，BC產(chǎn)量不再繼續(xù)增加。這表明適度的超聲波處理，可促進木醋桿菌合成BC。但是處理時間超過60 s，會導致木醋桿菌細胞的破碎，鏡檢結(jié)果見圖4。該試驗結(jié)果與鄧毛程等的研究結(jié)果相似。

圖4 超聲處理對木醋桿菌菌體的影響

3 結(jié) 論

采用化學法（吐溫-80和有機溶劑）和物理法（超聲波）處理木醋桿菌細胞，對BC的合成及菌體生長的均有影響。

a）吐溫-80的添加量增至0.04%，BC的產(chǎn)量是對照組的1.23倍，但是菌體量下降了11.6%。這說明吐溫-80一方面可以促進BC的合成，另一方面能對菌體細胞產(chǎn)生損傷作用。

b） 采用有機溶劑（丙酮、氯仿和甲苯） 處理木醋桿菌細胞，當添加量為0.05%時，對BC的合成均有輕微的促進作用。繼續(xù)增加有機溶劑添加量，特別是毒性較大的氯仿和甲苯，能導致BC和菌體量急劇下降，這說明氯仿和甲苯會對細胞造成大的損傷。

c） 采用超聲波清洗機超聲處理達到60 s時，BC產(chǎn)量是對照組的1.08倍。超聲處理超過60 s后，BC產(chǎn)量不再增加，鏡檢可看到菌體碎片。這說明適度的超聲可以促進BC的合成，超聲時間過長會導致菌體破碎。

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Effect of cellmembrane permeability on yield of bacteria cellulose produced by acetobacter xylinum

TANG Weihua1*JIA Shiru2

1（Department of Biological Engineering,Tianjin Modern Vocational Technology College,Tianjin 300350，China）

2（Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory,Tianjin 300457，China）

細菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是由微生物產(chǎn)生的一類純纖維素。采用化學法（表面活性劑和有機溶劑）和物理法（超聲波）改變細胞膜的通透性，旨在提高BC的產(chǎn)量。試驗結(jié)果表明，當吐溫-80的添加量達到4.0%（v/v）時，BC的產(chǎn)量是對照組的1.23倍；有機溶劑（丙酮、甲苯和氯仿）對BC的合成無明顯的促進作用，當氯仿和甲苯添加量分別增至3.0%和1.5%時，菌體量和BC產(chǎn)量均降至0；適度的超聲處理可促進BC的合成，當超聲處理時間為60 s時，BC是對照組的1.08倍。

木醋桿菌；細菌纖維素；有機溶劑；超聲波；吐溫-80

The bacterial cellulose is a kind ofhigh puritycellulose produced bymicroorganism.The permeabilityofcell membrane was changed bychemical method(surface active agent and organic solvent)and physical method(ultrasonic),which was aimed to increase the yield of bacterial cellulose.The results showed that,the yield of bacterial cellulose was 1.23timesofthecontrolgroupastheamountoftween-80 was4%(v/v).Organicsolvents(acetone,tolueneand chloroform)had nosignificant effect on the synthesis ofbacterial cellulose.When the amount ofchloroformand toluene was increased to 3%and 1.5%respectively,the biomass and the yield of bacterial cellulose decreased to 0.Appropriate ultrasound treatment can promote the synthesis ofbacterial cellulose,when the ultrasonic treatment time is 60 s,BCis 1.08 times of thecontrolgroup.

acetobacter xylinum；bacterial cellulose；organic solvent；ultrasonic；tween-80

TS261.1+3

A

1673-6044（2017）01-0013-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.01.006

*湯衛(wèi)華，女，1979年出生，2009年畢業(yè)于天津科技大學發(fā)酵工程專業(yè)，教授。

2016-09-01