大腸桿菌快速檢測原料4-甲基傘形酮葡糖酸苷在食品檢測中應(yīng)用效果研究*

李新章杭臣臣趙家龍

（1南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司，江蘇南通226011） （2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)納米科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州215123）（3安徽省鳳陽縣動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽鳳陽233100）

大腸桿菌快速檢測原料4-甲基傘形酮葡糖酸苷在食品檢測中應(yīng)用效果研究*

李新章1**杭臣臣2趙家龍3

（1南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司，江蘇南通226011） （2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)納米科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州215123）（3安徽省鳳陽縣動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽鳳陽233100）

食源性疾病已成為頭號食品安全問題。導(dǎo)致食源性疾病的致病菌廣泛存在于食物中。可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病菌主要有痢疾桿菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、鼻疽桿菌、結(jié)核菌、布氏桿菌、豬丹毒桿菌等。其中最為常見的食源性致病菌是大腸菌群，因此大腸菌群的檢測是食品安全評價中重要的微生物檢測項(xiàng)目。近年來，國內(nèi)外關(guān)于大腸菌群檢測做了大量研究工作。目前，用于大腸菌群檢測的方法主要有乳糖膽鹽發(fā)酵法、紙片法、乳糖多管發(fā)酵法，它們存在操作復(fù)雜，檢測時間長，難以推廣的問題。

4-甲基傘形酮葡糖酸苷（4-Methylumbellifery-B-D-Glucuronide，MUG）是一種生物顯色劑。MUG可以被大腸桿菌的糖苷酶水解，并產(chǎn)生一種強(qiáng)熒光物質(zhì)—4-甲級傘形酮（4-MU），從而以藍(lán)色熒光信號的形式直觀的指示該物質(zhì)已被大腸桿菌污染。由于其具有操作簡單，檢測時間長，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。同時市場上對MUG培養(yǎng)基的需求量也日益增加，但是長久以來，國內(nèi)MUG市場都被進(jìn)口品牌占據(jù)，且價格居高不下。為此公司前期開發(fā)出較高純度和價格較低的MUG原料，通過比較常用進(jìn)口Sigma的MUG與本公司開發(fā)出的MUG在食品中檢測大腸桿菌污染的效果，以檢驗(yàn)本公司的MUG實(shí)際使用效果。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的材料均購自當(dāng)?shù)厥称烦?，隨機(jī)取未開包裝的產(chǎn)品11種，各30份。

1.2 主要試劑及儀器

水相濾膜，孔徑為0.45 um；MUG，Sigma科技有限公司；胰蛋白酶，上海生物工程有限公司；真空泵、366nm紫外燈，南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；其它試劑，分析純，南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

固體：無菌操作稱取樣品25 g，置于裝有255mL滅菌的生理鹽水的容器中，充分振搖、混勻。

液體樣品：牛奶樣品在室溫（23℃～27℃）下經(jīng)蛋白酶處理，其他樣品不做處理。以無菌吸管吸取樣品25mL置于裝有225mL滅菌生理鹽水（牛奶樣品用滅菌的蛋白胨吐溫80稀釋液）的容器中，以30cm幅度于7 s內(nèi)振搖25次。制成1:10的樣品稀釋液備用。

1.3.2 分別用1 mol/L氫氧化鈉或1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)樣品稀釋液的pH值，將上述制備好的稀釋液用9mL滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍遞增稀釋，直至最高稀釋度的檢測結(jié)果達(dá)到陰性終點(diǎn)。（每一稀釋度換用1支1mL無菌吸管或移液器吸頭，上一稀釋度用的吸管或吸頭不要觸及下一稀釋度的稀釋液。）從制備樣品稀釋液至稀釋完畢，全過程不超過15min（牛奶樣品不超過45min）。

1.3.3 將滅菌過濾裝置連接于真空抽濾瓶上，無菌操作將無菌濾膜放在抽濾底座上并固定。無菌操作加入10mL～20mL無菌蒸餾水于濾器中，打開真空泵，抽吸過濾，再從1.3.2中選取適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度分別過濾，每次10mL。最后再加入10mL～15mL無菌蒸餾水，抽吸過濾后，關(guān)閉真空泵，用無菌鑷子將濾膜取出于備用。

1.3.4 無菌操作將1.3.3樣品過濾后的濾膜貼放于預(yù)先干燥的BMA瓊脂平板表面上，濾膜與瓊脂表面之間應(yīng)無氣泡。放入36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在暗室或紫外操作室內(nèi)用波長366nm紫外燈觀察濾膜上的菌落是否有藍(lán)白色熒光。選用菌落數(shù)范圍在25個～250個之間的平板，計算藍(lán)白色熒光的菌落數(shù)并相加，再乘以其稀釋倍數(shù)后，計算樣品中大腸菌群或大腸桿菌數(shù)（cfu/g或cfu/mL)。

1.4 產(chǎn)品合格評價方法

根據(jù)產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB8537-2008飲用天然礦泉水、GB 17401-2014膨化食品、GB 17400-2015方便面、GB 7101-2015飲料、GB 19645-2010巴氏殺菌乳）與檢測結(jié)果評價產(chǎn)品是否合格。

2 結(jié)果與分析

自制MUG與進(jìn)口品牌MUG在食品中檢測大腸桿菌數(shù)量的檢測結(jié)果評價食品合格情況見下頁表1。

由表1可知，自制MUG與進(jìn)口品牌MUG應(yīng)用在食品檢測中所得的大腸桿菌數(shù)，用于評價食品樣品合格與不合格結(jié)果均一致，且兩種MUG檢測出的不合格食品均為同一份食品。本研究結(jié)果表明本公司自制的MUG可以替代進(jìn)口MUG用于食品中大腸桿菌的檢測中。

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)MUG相關(guān)的試劑市場基本被Sigma公司占據(jù)，國內(nèi)幾乎沒有大規(guī)模的成品提供商。由于Sigma公司MUG已經(jīng)被廣泛用在食品檢測中，其已經(jīng)成為行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。如其它企業(yè)制備的MUG產(chǎn)品中性狀、純度、雜質(zhì)種類與Sigma公司產(chǎn)品不一致，可能會導(dǎo)致顯色時間和顯色效果更差，甚至由于雜質(zhì)的毒性導(dǎo)致大腸桿菌的死亡，進(jìn)而導(dǎo)致最終的檢測效果比Sigma公司的MUG更差。本研究結(jié)果表明Sigma公司的MUG與自制的MUG應(yīng)用于食品安全檢測中具有相同效果，此結(jié)果雖然并不能說明自制的最終MUG的性狀、純度、雜質(zhì)、甚至有毒雜質(zhì)完全一致，但本研究直接說明兩種MUG用在食品檢測中的最終效果是一致的，所以自制的MUG能夠替代Sigma公司MUG。未來筆者將對自制MUG的性狀、雜質(zhì)成分、結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行深入的分析，以獲得更為全面的數(shù)據(jù)信息。

表1 自制MUG與進(jìn)口品牌MUG在食品中檢測大腸桿菌數(shù)量的檢測結(jié)果評價食品合格情況

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［2］李平，彭金紅，王國洪，等.食品中大腸茵群兩種測定方法的比較［J］.疾病監(jiān)測與控制，2012，06（8）:491-492.

［3］馬延霞，吳清平，張菊梅，等.大腸菌群特異性檢測熒光底物MUGal的合成及應(yīng)用［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30（8）：251-257.

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［6］朱佳玲，董紀(jì)昌.酶-底物快速檢測試劑Mugal的合成及應(yīng)用［J］.化學(xué)試劑，1997，19（4）：210-212.

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Study on application effect of 4-Methylumbellifery-B-D-Glucuronide used in food safe analysis

LI Xinzhang1*HANG Chencheng2ZHAO Jialong3

1（Nantongkaiheng biological technologydevelopment Co.,Ltd.,Jiangsu Nantong 226011，China）

2（College ofnanoscience and technologyin the university ofscience and technology of China，Jiangsu Suzhou 226011，China）

3（Center ofanimal disease control and prevention in fengyangcity ofanhui province，Anhui Fengyang 233100，China）

比較自制的4-甲基傘形酮葡糖酸苷（MUG）與國際品牌的MUG在檢測食品中大腸桿菌活菌數(shù)的應(yīng)用效果，研究結(jié)果表明，利用自制的MUG與品牌的MUG檢測食品中的大腸桿菌活菌數(shù)所得結(jié)果，對評價產(chǎn)品是否合格的具有相同效果，表明自制的MUG完全能夠替代國際品牌的MUG應(yīng)用于檢測食品中的大腸桿菌活菌數(shù)。

大腸桿菌；快速檢測原料；4-甲基傘形酮葡糖酸苷；應(yīng)用效果

The selfmade 4-Methylumbellifery-B-D-Glucuronide（MUG） and MUGofinternational brand were applied in checkingthe number ofEscherichia coli in food.The results showed that the application effect has no significant difference in qualified inspection.The studysuggest that selfmade MUGcan completelyreplace MUGof international brand used in checkingthe number ofEscherichia coli.

escherichia coli；rapid detection material；4-Methylumbellifery-B-D-Glucuronide；application effect

TS207.4

A

1673-6044（2017）01-0058-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.01.017

南通市港閘區(qū)小微企業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2015D121）

** 李新章，男，1985年出生，2010年畢業(yè)于蘇州大學(xué)藥劑學(xué)專業(yè)，工程師。

2017-02-08