不同濃度米諾環(huán)素刺激骨髓細(xì)胞對小鼠體外肝細(xì)胞損傷的影響

文 翠 肖 芳 徐凱智 趙 昕 王曉群 陳 楠 劉慶陽

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科 河北唐山 063000；①保定市婦幼保健院，②煤炭總醫(yī)院

不同濃度米諾環(huán)素刺激骨髓細(xì)胞對小鼠體外肝細(xì)胞損傷的影響

文 翠 肖 芳①徐凱智 趙 昕 王曉群 陳 楠 劉慶陽②

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院麻醉科 河北唐山 063000；①保定市婦幼保健院，②煤炭總醫(yī)院

①目的 探討不同濃度米諾環(huán)素刺激的骨髓細(xì)胞對體外培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。②方法 獲取C57BL/6小鼠同基因背景下綠色熒光骨髓細(xì)胞，分為6組：對照組(b0組)、不同濃度米諾環(huán)素刺激組(b1～5組)。b0組為單純骨髓細(xì)胞培養(yǎng)組，b1～5組分別加入不同濃度(5、10、20、50、100μg/mL)米諾環(huán)素；將b0～5組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)24小時后，各取出一部分骨髓細(xì)胞用MTT法檢測其增生率；獲取C57BL/6小鼠肝細(xì)胞，分為8組(a、aL、a0～5組)，除對照組(a組，為單純肝細(xì)胞培養(yǎng)組)外，其余各組加入終濃度100μg/mL的脂多糖(LPS)，建立肝細(xì)胞損傷模型。a0～5組分別相應(yīng)加入b0～5組培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞2×106個，a、aL組加入等容積的PBS液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2天換液，動態(tài)觀察肝細(xì)胞生長情況并檢測肝細(xì)胞的凋亡率。③結(jié)果 與b0組相比，不同濃度米諾環(huán)素刺激24小時后骨髓細(xì)胞的增生率有所不同，b1組(5μg/mL)最高，b5組(100μg/mL)最低。與a組相比較，aL肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，凋亡率增加；a0～5組肝細(xì)胞有不同程度的增殖,其凋亡率有所降低，以低濃度5μg/mL效果最優(yōu)。④結(jié)論 本次實驗顯示5μg/mL的米諾環(huán)素刺激的骨髓細(xì)胞對體外受損肝細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為米諾環(huán)素提高骨髓細(xì)胞增生率，增加骨髓細(xì)胞活性，從而降低肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。

米諾環(huán)素 膿毒癥 肝細(xì)胞 骨髓細(xì)胞

膿毒癥(sepsis)是由多種原因引起伴隨感染的全身炎性反應(yīng)綜合征，常導(dǎo)致膿毒癥休克(septic shock)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS ),甚至死亡。肝臟在人體代謝和免疫平衡中起著重要的作用。在膿毒癥中，肝臟代謝障礙和凝血因子合成障礙等會進(jìn)一步造成多器官功能障礙從而導(dǎo)致臨床死亡[1]，改善及維持肝功能能夠有效降低器官功能障礙死亡率[2]。骨髓細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為多種組織細(xì)胞，例如肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等，是肝細(xì)胞的重要肝外來源[3]，骨髓細(xì)胞移植治療肝損傷也備受人們關(guān)注，但骨髓細(xì)胞移植不是一個單純的治療過程，受到諸如時效性、原發(fā)病治療效果欠佳等的限制。如何為移植骨髓細(xì)胞提供一個有利的環(huán)境，使其達(dá)到更佳的治療效果成為學(xué)者們的關(guān)注點。本研究的目的是探討不同濃度米諾環(huán)素刺激的骨髓細(xì)胞對小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑

1.1.1實驗動物 健康成年雄性C57BL/6小鼠，清潔級，6～8周齡，體質(zhì)量(20±1)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京) 2015-0004。食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，術(shù)前禁食12小時，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在22℃左右, 濕度保持在60%～70%。

1.1.2主要藥物和試劑 米諾環(huán)素(Minocycline Hydrochloride，阿拉丁公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco 公司；胎牛血清：杭州四季青生物材料有限公司；AnnexinV/7-AAD：美國ebioscience公司；MTT試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑：北京索萊寶生物科技有限公司。米諾環(huán)素粉劑用生理鹽水配制， 37℃水浴使其完全溶解，MTT粉劑用生理鹽水配成5mg/mL的無菌儲存液，4℃避光保存。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞的制備 ①骨髓細(xì)胞：C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒15分鐘。無菌條件下取出雙側(cè)股骨干，PBS 10mL沖洗骨髓腔，沖洗干凈后棄股骨干，將沖出的骨髓吹打混勻，1500r/min離心5分鐘，棄上清，加入無菌PBS 1mL重懸，臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活力,要求在95%以上,計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107cell/mL。②肝臟細(xì)胞：獲取C57BL/6小鼠，用0.5%戊巴比妥鈉15mg/kg麻醉，于75%酒精中浸洗消毒，仰臥位固定，無菌操作下開腹，在遠(yuǎn)離肝臟處結(jié)扎門靜脈，導(dǎo)管插入下腔靜脈胸段，用絲線固定，近肝臟處剪破門靜脈，結(jié)扎肝動脈、脾靜脈、下腔靜脈與腎靜脈匯合處，以9mL/min速度灌注PBS 15分鐘，以6mL/min速度灌注I 型膠原酶，循環(huán)灌注10分鐘后取下肝臟放入DMEM中，依次經(jīng)100、150、180、280、400目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，以1500r/min離心2分鐘，棄上清，反復(fù)離心3次，下沉的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107cell/mL，臺盼藍(lán)染色測細(xì)胞活力95%以上。

1.2.2實驗細(xì)胞分組

1.2.2.1骨髓細(xì)胞分組 取96孔板，分為6組，每組設(shè)3個復(fù)空。分別為對照組(b0組，為單純骨髓細(xì)胞組)和不同濃度米諾環(huán)素刺激組(b1～5組)。無菌條件下將準(zhǔn)備好的熒光骨髓細(xì)胞加入孔板內(nèi)，每孔內(nèi)5×106個細(xì)胞，分別加入終濃度為5μg/mL(b1組)、10μg/mL(b2組)、20μg/mL(b3組)、50μg/mL(b4組)、100μg/mL(b5組)的米諾環(huán)素，b0組加入等容積的PBS液，吹打混勻，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每12小時吹打混勻一次，培養(yǎng)24小時。

1.2.2.2肝細(xì)胞分組 取準(zhǔn)備好的正常肝細(xì)胞，無菌條件下將1×107個正常肝細(xì)胞分別加入8個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，對照組(a組，為單純肝細(xì)胞組)，其余7組(aL、a0-5組)加入終濃度為100μg/mL的脂多糖(LPS)混勻，模擬體外膿毒癥肝損傷。取出b0～5組骨髓細(xì)胞2×106個，1500r/min離心5分鐘，棄上清，加入PBS液重懸，分別相應(yīng)加入a0～5組肝細(xì)胞內(nèi)混勻，用加胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整培養(yǎng)瓶內(nèi)容積到5mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，1～2天換液。

1.2.3檢測指標(biāo) ①骨髓細(xì)胞增殖情況：取b0-5組骨髓細(xì)胞2×106個，去掉各組上層培養(yǎng)液，加入 DMEM培養(yǎng)基100μL，再加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時后加入100μL 二甲基亞砜(DMSO)溶液，常溫下震蕩1分鐘，待Formanzan結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀在570nm處測定其OD值。調(diào)零孔加入等量的DMEM、MTT和DMSO。②肝細(xì)胞生長情況：分別在肝細(xì)胞培養(yǎng)的第1、3、5、7天無菌操作取出培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的生長情況并照相記錄。③肝細(xì)胞凋亡情況：培養(yǎng)第7天用0.25%胰蛋白酶消化后，用含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打取出各組細(xì)胞，1500r/min離心5分鐘，棄上清，加入PBS液重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106Cell/mL。取400μL重懸液，分別加入5μLAnnexinV和7-AAD混勻，室溫暗處染色15分鐘，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，試驗重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1不同濃度米諾環(huán)素對骨髓細(xì)胞的影響 與b0組相比，b1～4組骨髓細(xì)胞增生率增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(b1～3組P<0.01，b4組P<0.05)，其中以b1組增生最為明顯；而b5組骨髓細(xì)胞增生率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；b2組與b3組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 骨髓細(xì)胞增生率變化

注：與b0組比較，*P<0.05，**P<0.01；與b2組比較，#P>0.05

2.2體外培養(yǎng)肝細(xì)胞動態(tài)觀察 與a組相比，aL組肝細(xì)胞嚴(yán)重受損，破裂、懸浮細(xì)胞增多；a1～3組肝細(xì)胞生長情況較好，其中a1、a2組在培養(yǎng)第5天可見肝細(xì)胞聚團(tuán)，細(xì)胞島形成，a4、a5組界面稍渾濁，見不成形、破裂肝細(xì)胞，見圖1。

2.3體外培養(yǎng)肝細(xì)胞凋亡率 培養(yǎng)7天后，與a組比較，a1～5組肝細(xì)胞凋亡率均有不同程度的降低。與a組比較，a5組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；a1～4差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。a0組與a5組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

圖1 體外培養(yǎng)肝細(xì)胞動態(tài)觀察(×200)

組別n細(xì)胞凋亡率(%)a345.23±0.77aL357.23±0.76a0343.52±0.49a1324.35±0.48*a2331.17±0.59*a3339.30±0.59*a4341.94±0.73*a5344.42±0.55#

注：a：單純肝細(xì)胞；aL：肝細(xì)胞+LPS；a0：肝細(xì)胞+LPS+骨髓細(xì)胞；a1～5分別為(肝細(xì)胞+LPS)+5、10、20、50、100μg/mL米諾環(huán)素刺激24小時后的骨髓細(xì)胞。與a組比較，*P<0.05；與a0組比較，#P>0.05。

3 討論

膿毒癥發(fā)生率高，病情兇險，醫(yī)療資源消耗大，已經(jīng)嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。臨床醫(yī)師在治療膿毒癥的同時也關(guān)注膿毒癥時器官保護(hù)。肝臟是膿毒癥時受損最嚴(yán)重的器官之一，它對膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展有著舉足輕重的作用，其結(jié)構(gòu)、功能和代謝的變化影響著膿毒癥病情的發(fā)展。所以，膿毒癥時如何減輕肝臟的受損程度對于膿毒癥的治療和預(yù)后有著重大意義。

骨髓細(xì)胞是骨髓的主要組成單位，包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。骨髓細(xì)胞對肝臟保護(hù)作用的研究可以追溯到1999年，Petersen等將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞回輸?shù)郊毙愿螕p傷大鼠體內(nèi)，在第9天和第13天后檢測出了供體鼠來源的肝卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞[4]。近年來，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞能夠改善肝臟線粒體功能，從而保護(hù)梗阻性黃疸時肝臟細(xì)胞[5]。骨髓細(xì)胞移植技術(shù)是再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的前沿技術(shù)之一，但是無論在體內(nèi)或者體外，骨髓細(xì)胞的增生能力有限，且其進(jìn)入增生和衰老凋亡的過程都有嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制[6]。因此，對于如何為移植骨髓細(xì)胞提供一個積極的環(huán)境，加強(qiáng)骨髓細(xì)胞功能成為亟待解決的問題。本實驗通過體外實驗來觀察米諾環(huán)素刺激的骨髓細(xì)胞對受損肝臟的影響，以探討膿毒癥急性肝損傷積極的治療方法，為臨床抗生素的應(yīng)用提出了全新的見解。

米諾環(huán)素是第二代半合成的四環(huán)素類廣譜抗生素，具有良好的抑制炎性反應(yīng)的作用[7]，除此之外，它對神經(jīng)系統(tǒng)的多種疾病如神經(jīng)退化性疾病、急性缺血性腦卒中等也具有一定的保護(hù)作用[8,9]。已有研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素對肝臟和腎臟都有一定的保護(hù)作用[10～12]，此外，米諾環(huán)素還可以降低Caspase-3的活性從而抑制細(xì)胞凋亡[13]。功能良好的骨髓細(xì)胞對移植成功與否有重要的意義，因為只有良好功能狀態(tài)的骨髓細(xì)胞才有增殖活性，骨髓細(xì)胞增殖活性的高低能反映骨髓細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài)，陳凌波等研究發(fā)現(xiàn)將黃芪和當(dāng)歸 1:1配伍能促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖和分化[14]，黃麗萍等[15]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清能促進(jìn)骨髓粒系、紅系造血祖細(xì)胞的增殖，促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞DNA的合成。在本實驗中，5、10、20、50μg/mL米諾環(huán)素刺激骨髓細(xì)胞24小時后，骨髓細(xì)胞有不同的增生率，其中5μg/mL米諾環(huán)素組最高，這與張達(dá)等[16]研究結(jié)果(6μg/mL)大致一致;100μg/mL組增生率降低，這說明低濃度的米諾環(huán)素可以增加體外骨髓細(xì)胞增生率，使其發(fā)揮更好的細(xì)胞功能狀態(tài)，而高濃度米諾環(huán)素反而會抑制骨髓細(xì)胞增殖，10、20μg/mL米諾環(huán)素組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與實驗操作或小鼠例數(shù)有一定關(guān)系，有待進(jìn)一步探討。

肝細(xì)胞凋亡是膿毒癥肝損傷的重要機(jī)制之一。膿毒癥時激活Fas/Apo-1、TNF-α受體、轉(zhuǎn)化生長因子受體等，啟動線粒體凋亡信號，激活具有自我摧毀功能的mtPTP活化，通過凋亡途徑使細(xì)胞凋亡[17]，另外當(dāng)Bcl-2家族的兩個重要蛋白Bcl-2表達(dá)量減少，而Bax表達(dá)量增加導(dǎo)致兩者間的比率失衡時，也可引起細(xì)胞凋亡[18]。細(xì)胞凋亡嚴(yán)重影響組織器官功能，有報道稱骨髓細(xì)胞對降低細(xì)胞凋亡有一定作用，Cai等[19]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓細(xì)胞可通過抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖，從而對急性肝損傷起到保護(hù)作用。

本實驗采用LPS刺激肝臟細(xì)胞來模擬膿毒癥肝損傷模型，造模后肝臟細(xì)胞明顯受損，懸浮、破裂細(xì)胞增多。通過對肝細(xì)胞生長情況的觀察,a1 ～3組肝細(xì)胞在數(shù)目、形態(tài)上不同程度優(yōu)于a0組和aL組，可見肝細(xì)胞分裂、聚團(tuán)和細(xì)胞島的形成，其中a1組效果最好，a2組次之；各組肝細(xì)胞凋亡率方面，aL組凋亡率明顯高于a組，說明LPS對肝細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷，這與肝細(xì)胞生長情況相一致。a0 ～4組肝細(xì)胞體外培養(yǎng)凋亡不同程度低于a組。a5組肝細(xì)胞凋亡率雖低于a組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表2顯示隨著米諾環(huán)素濃度的增加，肝細(xì)胞凋亡率上升，但仍低于對照組，其中a1組米諾環(huán)素組最低，與肝細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果相符。這表明在本實驗中低濃度的米諾環(huán)素能促進(jìn)的骨髓增生，進(jìn)而能降低體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，對保護(hù)受損肝臟有積極作用。

綜上所述，低濃度(5μg/mL)的米諾環(huán)素刺激的骨髓細(xì)胞對體外受損肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其可能機(jī)制為米諾環(huán)素促進(jìn)骨髓細(xì)胞增生，而更好功能狀態(tài)的骨髓細(xì)胞降低肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖；在體外實驗中，米諾環(huán)素能夠增加骨髓細(xì)胞增生率的最佳濃度為5μg/mL。

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(2017-02-15 收稿)(張愛國 編輯)

Effectofdifferentconcentrationsminocyclinecombinedwithbonemarrowcellsonlivercellinsepticmice

WEN Cui,XIAO Fang,XU Kaizhi,et al

(North China University of Science and Technology,Affiliated to Tangshan Gongren Hospital,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo explore protective effect of different concentrations minocycline combined with bone marrow cells on liver cell in septic mice.MethodsGFP+bone marrow cells were divided into 6 groups:control group(b0group)、minocycline groups(b1～5groups). b1～5groups which were added at different concentrations(5、10、20、50、100μg/mL) of minocycline respectively,All groups were placed in 37℃ 5% CO2saturated humidity to be cultured for 24h,Then some of the cells were took out for the proliferation rate of bone marrow cells by MTT methods.Hepatocytes were divided into 8 groups:control group (a group)、hepatocytes injury groups(aL、a0～5groups) which were used LPS at the concentration of 100μg/mL to induce injury.GFP+ bone marrow cells from group b0～5were added to group a0～5while a、aLgroups were

equal volume of PBS instead.All groups were placed in 37℃,5% CO2saturated humidity to be cultured for 24h,the growth of hepatocytes was observed and the apoptosis were detected.ResultsCompared with the b0group,different concentrations of minocycline stimulated 24 hours after the proliferation rate of bone marrow was different,The proliferation rate of bone marrow cells was the highest in b1group (5μg/mL),and the proliferation rate of bone marrow cells in b5group (100μg/mL) was the lowest.Compared with the a group,aL hepatocytes were damaged and the apoptosis rate was increased.The hepatocytes of group a0～5had different degrees of proliferation,and the apoptotic rate was decreased with the lowest concentration of 5μg/mL.ConclusionIn this experiment,5μg/mL minocycline combined with bone marrow cells in vitro damage to liver cells have protective effect,the mechanism may be minocycline to improve bone marrow cell proliferation rate,increase bone marrow cell activity,thereby reducing liver cell apoptosis death and promote hepatocyte proliferation.

Minocycline.Sepsis.Liver cell.Marrow cells

R 631

A

2095-2694(2017)05-337-06

國家自然科學(xué)基金(編號：81272140，81000847)；中國博士后面上項目(201150M1530)。

文 翠(1989-)，女，碩士研究生，醫(yī)師。研究方向：器官保護(hù)。

徐凱智 劉慶陽。