槲皮素改善高糖損傷大鼠冠脈肌原性反應(yīng)的機(jī)制研究*

侯曉敏， 張明升， 趙良淵， 齊鼎銘， 秦小江△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2公共衛(wèi)生學(xué)院， 山西 太原 030001)

槲皮素改善高糖損傷大鼠冠脈肌原性反應(yīng)的機(jī)制研究*

侯曉敏1， 張明升1， 趙良淵2， 齊鼎銘1， 秦小江2△

(山西醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2公共衛(wèi)生學(xué)院， 山西 太原 030001)

目的通過大鼠冠狀動脈(coronary artery，CA)張力測定和全細(xì)胞膜片鉗記錄CA血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的電壓門控性鉀通道(voltage-gated K+channel， Kv)電流，研究槲皮素改善高糖損傷大鼠CA肌原性反應(yīng)的機(jī)制。方法從正常SD大鼠急性分離得到CA環(huán)，然后分成6組：(1)正常對照組；(2)高糖組；(3)高糖+低劑量(3 μmol/L)槲皮素組;(4)高糖+中劑量(10 μmol/L)槲皮素組;(5)高糖+高劑量(30 μmol/L)槲皮素組;(6)高糖+蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑C6303+高劑量槲皮素組。利用血管張力測定，檢測CA環(huán)對血管收縮劑(60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619)的反應(yīng)，并將CA環(huán)用60 mmol/L KCl預(yù)收縮后，用乙酰膽堿(acetylcholine，ACh； 10-9～10-5mol/L)進(jìn)行舒張，計(jì)算ACh引起CA 環(huán)張力下降幅度與預(yù)先收縮的百分比。急性分離得到大鼠CA的VSMC，然后記錄Kv電流。結(jié)果與正常対照組相比，高糖組CA環(huán)對60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619的反應(yīng)明顯升高；中、高劑量槲皮素的干預(yù)可以使高糖所致CA環(huán)對血管收縮劑的反應(yīng)降低，孵育PKC特異性抑制劑C6303可減弱槲皮素的作用。與正常對照組相比，高糖組大鼠離體CA環(huán)對ACh的舒張幅度明顯減弱。槲皮素的干預(yù)可以改善高糖孵育的大鼠離體CA環(huán)對ACh的舒張反應(yīng)，C6303可以減弱槲皮素的作用。高糖孵育明顯抑制CA VSMC的Kv電流，槲皮素干預(yù)可以減弱高糖對CA VSMC Kv電流的影響，孵育C6303可減弱槲皮素的作用。結(jié)論槲皮素對高糖損傷大鼠CA肌原性反應(yīng)具有保護(hù)作用，該作用與增大VSMC的Kv電流和激活PKC有關(guān)。

槲皮素； 冠狀動脈； 高糖； 電壓門控性鉀通道； 蛋白激酶C

糖尿病損傷血管的基礎(chǔ)致病原因?yàn)楦邼舛绕咸烟菗p傷血管細(xì)胞，其中高血糖對冠狀動脈(coronary artery，CA)損害引發(fā)的冠心病為其致死的首要原因。而且高血糖可以損傷CA血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)上的某些離子通道，如電壓門控性鉀通道(voltage-gated K+channels，Kv)[1]。

Kv是動脈VSMC上表達(dá)最多的鉀離子通道[2]。CA給心肌細(xì)胞提供養(yǎng)分，其管壁主要是VSMC。有研究報(bào)道，Kv對調(diào)節(jié)CA肌張力非常重要[3]。

槲皮素(quercetin，Que)是一種典型的黃酮類化合物[4]，其生物學(xué)作用極其廣泛，能夠降低血脂水平[5]、拮抗心肌缺氧-復(fù)氧損傷[6]、抑制心肌細(xì)胞肥大[7]等。本課題組前期研究顯示，槲皮素可降低大鼠CA張力，該作用與增大CA VSMC的Kv電流有相關(guān)性[8]。據(jù)報(bào)道，膳食中增加一定量的槲皮素，不僅可以降低糖尿病大鼠血糖水平[9]，還可以降低糖尿病相關(guān)心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[10]，然而關(guān)于槲皮素對高糖損傷大鼠的CA有何影響尚未見報(bào)道。

鑒于高濃度葡萄糖能夠通過抑制CA VSMC的Kv引起大鼠CA損傷，而槲皮素舒張大鼠CA又與增大CA VSMC的Kv電流有關(guān)，我們提出科學(xué)假設(shè)——槲皮素能夠通過改善Kv功能減輕高糖所致CA肌原性反應(yīng)障礙。而且最近有相關(guān)研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是調(diào)節(jié) Kv 功能和表達(dá)的重要中介[11]，基于此，本項(xiàng)目將進(jìn)一步通過應(yīng)用PKC抑制劑C6303探討槲皮素作用的相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動物

實(shí)驗(yàn)所用健康SD大鼠購于山西醫(yī)科大學(xué)動物中心，合格證編號：SCXY(晉)2015-0001。

2實(shí)驗(yàn)試劑

槲皮素、C6303和HEPES(Sigma)；其余試劑均購自北辰方正試劑公司。

3方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組 從正常大鼠心臟急性分離得到CA環(huán)，首先利用血管張力記錄儀驗(yàn)證其活性，選取對血管收縮劑反應(yīng)良好的CA環(huán)用于高糖(high glucose，HG；25 mmol/L)孵育CA環(huán)實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中保證CA環(huán)浸潤于37 ℃、O2飽和HEPES緩沖液中，實(shí)驗(yàn)分組如下(每組6根CA環(huán)，且每根血管分別來源于不同大鼠)：(1)正常對照(control)組：正常HEPES液，葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L；(2)HG組：HEPES 液，葡萄糖終濃度為25 mmol/L；(3)HG+低劑量Que組： 低劑量(3 μmol/L)Que預(yù)處理CA環(huán)后，浸潤于高糖(25 mmol/L) HEPES液中；(4)HG+中劑量Que組：中劑量(10 μmol/L)Que預(yù)處理CA環(huán)后，浸潤于高糖(25 mmol/L)HEPES液中；(5)HG+高劑量Que組：高劑量(30 μmol/L)Que預(yù)處理CA環(huán)后，浸潤于高糖(25 mmol/L)HEPES液中；(6)HG+C6303+高劑量Que組：依次用PKC抑制劑C6303(1 μmol/L)和Que(30 μmol/L)預(yù)處理CA環(huán)后，浸潤于高糖(25 mmol/L)HEPES液中。

3.2離體CA環(huán)張力測定 參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[8]，通過血管張力記錄儀測定CA環(huán)張力。記錄各組大鼠CA環(huán)對收縮劑(60 mmol/L KCl或0.1 mmol/L U46619)的反應(yīng)，以及將CA環(huán)用KCl預(yù)收縮后，觀察其對血管舒張劑[乙酰膽堿(acetylcho-line，ACh)；10-9～10-5mol/L]的舒張反應(yīng)。

3.3膜片鉗記錄大鼠CA VSMC的Kv電流 本部分實(shí)驗(yàn)方法同本課題組前期研究[8]，選取Que的實(shí)驗(yàn)劑量為30 μmol/L，分組處理CA環(huán)后，急性分離得到大鼠CA的VSMC，然后以全細(xì)胞膜片鉗記錄各組大鼠CA VSMC的Kv電流，從-60 mV開始，一直刺激到+60 mV，計(jì)算最后50 ms的電流平均值，用細(xì)胞的電容標(biāo)化其電流，得到電流密度值，并繪制I-V曲線。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行，應(yīng)用Graph-Prism 6.01作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組大鼠CA環(huán)對血管收縮劑的反應(yīng)

正常對照組CA環(huán)對60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619的收縮幅度分別為(3.1±0.4) mN和(3.6±0.3) mN；高糖孵育大鼠離體CA環(huán)48 h后，CA環(huán)對60 mmol/L KCl的收縮幅度增加到(5.0±0.3) mN，對0.1 mmol/L U46619的最大收縮幅度增加到(5.3±0.4) mN；中、高劑量槲皮素的干預(yù)可以降低高糖所致CA環(huán)對KCl和U46619的收縮反應(yīng)；C6303可以減弱槲皮素的作用，見圖1。

Figure 1. The contraction amplitude of CA ring to KCl or U46619. Mean±SD.n=6 .**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG；△P<0.05vsHG+Que (30 μmol/L).

圖1CA對血管收縮劑的收縮反應(yīng)

2各組大鼠CA環(huán)對血管舒張劑的反應(yīng)

正常對照組大鼠CA環(huán)對ACh的舒張最大百分比為(70.1±3.1)%，而高糖孵育大鼠離體CA環(huán)48 h后，CA環(huán)對ACh的舒張反應(yīng)與對照組相比顯著降低(P<0.01)。槲皮素的干預(yù)可以改善高糖孵育大鼠離體CA環(huán)對ACh的舒張反應(yīng)(P<0.05)；C6303可以減弱槲皮素的作用(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The diastolic reaction of CA ring to ACh. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG;△△P<0.01vsHG+Que (30 μmol/L).

圖2CA對ACh的舒張反應(yīng)

3各組大鼠CAVSMC的Kv電流

正常対照組在+60 mV時(shí)CA VSMC的Kv電流密度為(53.41±3.25) pA/pF，高糖孵育明顯抑制大鼠CA VSMC的Kv電流，其在+60 mV時(shí)CA VSMC的Kv電流密度為(23.52±2.24) pA/pF；高劑量(30 μmol/L)槲皮素干預(yù)可以削弱高糖對CA VSMC Kv電流的影響；C6303可減弱槲皮素的作用，見圖3。

Figure 3. The Kv current density of CA VSMC. A: theI-Vcurve of Kv current density; B: the Kv currents evoked by a test pulse at +60 mV. Mean±SD.n=6 .**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG；△P<0.05vsHG+Que (30 μmol/L).

圖3膜片鉗記錄CAVSMC的Kv電流

討 論

據(jù)報(bào)道，高糖可以使血管對許多血管活性物質(zhì)的反應(yīng)發(fā)生改變[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中我們通過觀察離體大鼠CA對血管收縮劑和舒張劑的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，空白對照組中CA環(huán)對KCl和U46619的收縮幅度分別為(3.1±0.4)mN和(3.6±0.3)mN，高糖孵育大鼠離體CA血管環(huán)48 h后，其CA環(huán)的肌原性反應(yīng)發(fā)生了明顯變化，對血管收縮劑的收縮反應(yīng)顯著提高，其最大收縮幅度分別上升為(5.0±0.3) mN和(5.3±0.4) mN，而對ACh的舒張反應(yīng)卻明顯減弱。這提示我們，高糖孵育對CA環(huán)的內(nèi)皮造成了一定程度的損傷。而中、高劑量的槲皮素干預(yù)后，其上述變化得到了一定程度的改善，說明槲皮素對CA環(huán)的內(nèi)皮具有一定程度的保護(hù)作用。

有研究報(bào)道，Kv開放可舒張動脈平滑肌[3, 14]，Kv 在調(diào)節(jié)CA肌張力方面起關(guān)鍵作用[3]。本實(shí)驗(yàn)中高糖孵育大鼠CA環(huán)48 h后，急性分離得到CA的VSMC，用全細(xì)胞膜片鉗記錄CA VAMC Kv電流發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，高糖組Kv電流顯著降低，其在+60 mV處的電流密度由(53.41±3.25) pA/pF降低至(23.52±2.24) pA/pF，而高劑量槲皮素干預(yù)削弱了高糖組CA VSMC Kv電流的下降幅度。

為了進(jìn)一步探討槲皮素對高糖孵育CA環(huán)肌原性反應(yīng)改變與PKC的關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中我們應(yīng)用了PKC特異性抑制劑C6303，發(fā)現(xiàn)該抑制劑的使用可部分逆轉(zhuǎn)槲皮素前述作用，這些結(jié)果均提示槲皮素對高糖所致CA環(huán)肌原性反應(yīng)改變與激活PKC有關(guān)。

綜上所述，槲皮素可改善高糖損傷的大鼠CA肌原性反應(yīng)，該作用與增大VSMC的Kv電流和激活PKC有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)

鑒定T細(xì)胞受體譜系中的特異性組

T細(xì)胞受體(T-cell receptor, TCR)的序列非常多樣，比任何一個(gè)個(gè)體的T細(xì)胞有更多的可能序列組合。來自斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Glanville等采用肽和主要組織相容性復(fù)合體(peptide and major histocompatibility complex, pMHC)-四聚體(tetramer)分選的一組細(xì)胞和結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)來分析TCR序列，從而確定了TCR抗原特異性的最小要求。他們從這個(gè)分析中開發(fā)了一個(gè)算法，稱為GLIPH(grouping of lymphocyte interactions by paratope hotspots，通過互補(bǔ)位熱點(diǎn)的淋巴細(xì)胞相互作用分組)。他們用這個(gè)算法來聚類TCRs。由于保守基序的存在和互補(bǔ)性決定區(qū)3(complementarity-determining region 3, CDR3)序列的全局相似性，此方法的共享特異性(sharing specificity)概率很高。他們發(fā)現(xiàn)，GLIPH能夠可靠地將來自不同供體而具有共同特異性(common specificity)的TCR進(jìn)行分組，并且保守的CDR3基序有助于確定作為抗原肽經(jīng)常接觸點(diǎn)(often contact points)的TCR簇。他們從具有潛在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的22個(gè)個(gè)體的反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞中分析了5 711個(gè)TCRβ鏈序列，作為獨(dú)立驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。他們發(fā)現(xiàn)了141個(gè)TCR特異性組，包括16個(gè)不同的組，其中含有來自多個(gè)個(gè)體的TCR。這些TCR組通常共享HLA等位基因，可用于預(yù)測可能的HLA限制，并且大量結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞表位使得他們能夠鑒定所有五個(gè)測試組的pMHC配體。誘變(mutagenesis)和從頭TCR設(shè)計(jì)證實(shí)，GLIPH所鑒定的基序具有關(guān)鍵性，足夠用于共享抗原識別(shared-antigen recognition)。因此，GLIPH算法可以分析大量的TCR序列，并確定TCRs和個(gè)體共享的TCR特異性組，這大大加快了T細(xì)胞應(yīng)答的分析和特異性配體的鑒定。

Nature, 2017, 547(7661):94-98(李肖肖)

Mechanismofquercetinimprovingratcoronaryarterymyogenicresponseunderhighglucose

HOU Xiao-min1, ZHANG Ming-sheng1, ZHAO Liang-yuan2, QI Ding-ming1, QIN Xiao-jiang2

(1SchoolofBasicMedicalSciences，2SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:sxykdxyxy@163.com)

AIM: To investigate the mechanism of quercetin improving rat coronary artery myogenic response under high glucose (HG) by measuring muscle tension of coronary arterial ring and recording voltage-gated K+channel (Kv) current of coronary artery smooth muscle cells by whole cell patch clamp.METHODSThe coronary rings from the normal SD rats were acutely isolated, and then divided into 6 groups: (1) control group; (2) HG group; (3) HG+low dose (3 μmol/L) of quercetin group; (4) HG+moderate dose (10 μmol/L) of quercetin group; (5) HG+high dose (30 μmol/L) of quercetin group; (6) HG+C6303 (PKC inhibitor)+high dose of quercetin group. Determinations of coronary artery response to vasoconstrictor (60 mmol/L KCl or 0.1 mmol/L U46619) or vasodilator (ACh at 10-9～10-5mol/L) were performed, and the percentage of coronary ring tension was calculated using the contraction as 100% caused by 60 mmol/L KCl. The rat coronary artery smooth muscle cells were acutely isolated for recording the Kv current using whole cell patch clamp.RESULTSCompared with control group, the contraction amplitudes to 60 mmol/L KCl or 0.1 mmol/L U46619 were significantly increased under HG incubation. Quercetin intervention concentration-dependently reduced the coronary artery contraction amplitude. Incubation of PKC specific inhibitor C6303 attenuated the effect of quercetin. Compared with control group, the diastolic amplitude to ACh decreased significantly in HG group, and quercetin intervention concentration-dependently increased the coronary artery diastolic amplitude. Incubation of PKC specific inhibitor C6303 attenuated the effect of quercetin. Compared with control group, HG incubation inhibited Kv current of coronary artery vascular smooth muscle cells significantly, and quercetin intervention attenuated the inhibitory effect of HG on Kv current intensity. Incubation of PKC specific inhibitor C6303 attenuated the effect of quercetin.CONCLUSIONQuercetin has a protective effect on myogenic response of coronary artery under HG and the effects is related to the increase in Kv current and the activation of PKC in vascular smooth muscle cells.

Quercetin; Coronary artery; High glucose; Voltage gated K+channels; Protein kinase C

R587.1; R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.011

1000- 4718(2017)10- 1801- 05

2017- 04- 06

2017- 07- 07

山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金(No. 03201510； No. 03201521)；山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目(No. 2017146； No. 2017147)；山西省青年科技研究基金(No. 201701D221247； No. 201701D221259)； 山西醫(yī)科大學(xué)青年基金(No. 02201604； No. 02201613)

△通訊作者 Tel: 0351-4639120； E-mail: sxykdxyxy@163.com

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