FSD-C10調(diào)節(jié)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠炎性微環(huán)境*

谷青芳， 尉杰忠▲ ， 吳 昊， 李艷花， 樊慧杰， 柴 智，王 青， 肖保國,3， 馬存根,△

(1大同大學(xué)腦科學(xué)研究所， 山西 大同 037009； 2山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 太原 030024； 3復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所， 上海 200025)

·論著·

FSD-C10調(diào)節(jié)阿爾茨海默病雙轉(zhuǎn)基因小鼠炎性微環(huán)境*

谷青芳1， 尉杰忠1▲， 吳 昊1， 李艷花1， 樊慧杰2， 柴 智2，王 青2， 肖保國1,3， 馬存根1,2△

(1大同大學(xué)腦科學(xué)研究所， 山西 大同 037009；2山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 太原 030024；3復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所， 上海 200025)

目的探討新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)模型小鼠腦內(nèi)炎性微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。方法采用雙轉(zhuǎn)染人β-淀粉樣蛋白前體(β-amyloid protein precursor，APP)695swe基因和人早老素1(presenilin-1，PS1)ΔE9突變基因的8月齡小鼠作為AD動(dòng)物模型，隨機(jī)分為模型組和FSD-C10治療組，分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水和FSD-C10 (25 mg·kg-1·d-1)持續(xù)治療2個(gè)月，同月齡野生型小鼠作為正常對照組。應(yīng)用Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。采用免疫組化和Western blot技術(shù)檢測小鼠腦組織β-淀粉樣蛋白(Aβ)、磷酸化Tau蛋白(p-Tau)、β位點(diǎn)APP剪切酶(BACE)、Toll樣受體4(TLR-4)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，F(xiàn)SD-C10干預(yù)能顯著改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，減少海馬區(qū)Aβ1-42、p-Tau和BACE的表達(dá)，抑制腦內(nèi)炎癥信號通路TLRs/NF-κB軸TLR-4的表達(dá)和p-NF-κB的激活，減少iNOS的表達(dá)，增加Arg-1的表達(dá)。結(jié)論FSD-C10干預(yù)能明顯改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，其機(jī)制可能是通過抑制TLRs/NF-κB信號通路激活，減少炎癥因子的分泌及促進(jìn)M1型炎性小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織炎癥微環(huán)境。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠； FSD-C10； 炎癥微環(huán)境； TLRs/NF-κB通路

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，預(yù)測到老齡化程度更為嚴(yán)峻的2050年，全球阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患病人數(shù)將超過1億[1]。迄今為止AD尚無特效藥物治療，2014年初輝瑞、強(qiáng)生、禮來公司聯(lián)合研發(fā)的抗Aβ單克隆抗體藥物治療AD的研究在III期臨床試驗(yàn)也遭到失敗。這些探索也讓人們開始重新審視AD的新藥研發(fā)和治療策略。

研究發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase，ROCK)的異常激活在AD的病理過程中扮演著重要的角色[2-3]。抑制ROCK的活性有利于防止炎癥反應(yīng)和神經(jīng)損傷。已有研究證實(shí)非甾體類抗炎藥通過抑制ROCK的活性降低AD的發(fā)病率[4]。因此，抑制ROCK可能是治療AD的有效策略。我們前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)ROCK抑制劑fasudil對AD具有良好的治療效果[5]，但其生物利用度差、長期使用的安全窗較小的缺點(diǎn)限制了它的臨床應(yīng)用。新型ROCK抑制劑FSD-C10的效價(jià)與fasudil等同，且對神經(jīng)元毒性小，對血管影響小?；诖?，本研究進(jìn)一步探討了FSD-C10 對雙轉(zhuǎn)染人β-淀粉樣蛋白前體(β-amyloid protein precursor，APP)/人早老素1(presenilin-1，PS1)基因的小鼠認(rèn)知功能及腦組織炎性微環(huán)境的作用，為開發(fā)新型ROCK抑制劑和臨床應(yīng)用ROCK抑制劑治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)共分3組，雄性8月齡APP695swe/PS1-ΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠16只隨機(jī)分為模型組與FSD-C10干預(yù)組，同窩雄性8 月齡C57BL/6小鼠8只作為正常對照組。上述小鼠體重18～22 g，購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循山西大同大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查委員會制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則執(zhí)行科學(xué)實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于室溫和光照可控的無菌動(dòng)物房清潔飼養(yǎng)[(25±2) ℃]，可自由進(jìn)食。

1.2主要試劑 BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；FSD-C10化合物由天津紅日藥業(yè)股份有限公司友好提供。

1.3主要儀器 Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)軟件SMART V3.0及硬件購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；冰凍切片機(jī)購自Leica；酶標(biāo)儀購于THERMO；凝膠成像分析儀購自Bio-Rad；熒光顯微鏡購自O(shè)lympus。

2方法

2.1AD模型鼠的建立APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可表達(dá)人APP695swe基因和PS1-ΔE9基因，能產(chǎn)生高水平的Aβ1-42纖維沉積，在8月齡時(shí)可出現(xiàn)Aβ老年斑，是國際通用的AD模型鼠之一。

2.2動(dòng)物分組及給藥APP/PS1實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為模型組與干預(yù)組，分別腹腔注射生理鹽水(0.9% NaCl，n=8)和FSD-C10(25 mg·kg-1·d-1，n=8)，持續(xù)給予2 個(gè)月，野生組取8只正常老齡小鼠作為對照同法給予等量生理鹽水。

2.3水迷宮檢測 水迷宮為直徑90 cm，高50 cm的圓形水池，裝滿用食用白色素調(diào)和形成的不透明的水，水迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，置于一個(gè)安靜、持續(xù)光照的地方，水溫保持在23～25 ℃。水迷宮硬件分為4個(gè)象限(NW、NE、SW和SE)，在SW象限放一個(gè)直徑5.0 cm的圓形平臺，平臺置于液面下2 cm。小鼠治療2個(gè)月后進(jìn)行5 d水迷宮訓(xùn)練，每天的上、下午各1次，訓(xùn)練小鼠從起點(diǎn)到達(dá)平臺的時(shí)間和距離，每次時(shí)長60 s，如果在60 s期間小鼠沒有到達(dá)平臺，則進(jìn)行引導(dǎo)幫助小鼠到達(dá)平臺，在小鼠到達(dá)平臺后停留10 s。在訓(xùn)練結(jié)束后，進(jìn)行為期5 d的認(rèn)知功能測定，然后撤除平臺進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)判斷小鼠對平臺空間位置的記憶能力。實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠游動(dòng)的蹤跡被SMART 3.0系統(tǒng)攝像頭跟蹤并記錄各項(xiàng)指標(biāo)，包括動(dòng)物從入水到平臺的時(shí)間、動(dòng)物達(dá)到平臺所在位置的平均距離、動(dòng)物第1次入水到達(dá)平臺所在象限(SW區(qū))時(shí)間、動(dòng)物在平臺象限滯留時(shí)間百分比、動(dòng)物在平臺象限滯留路徑百分比和動(dòng)物在平臺象限活動(dòng)度百分比等。

2.4免疫組化染色觀察 行為學(xué)測試結(jié)束后處死動(dòng)物，各組隨機(jī)選取4只小鼠，用4%多聚甲醛灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定，然后快速分離腦組織，包埋后行10 μm冠狀冰凍切片，切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；分別加抗Aβ1-42(1∶500，Millipore)、抗p-Tau(1∶500，Cell Signaling Technology)、抗β位點(diǎn)APP剪切酶(β-site APP-cleaving enzyme，BACE； 1∶500，Cell Signaling Technology)、抗Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR-4； 1∶500，Cell Signaling Technology)、抗核因子κB (nuclear factor-κB， NF-κB； 1∶500，Cell Signaling Technology)；抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS； 1∶500，Cell Signaling Technology)、抗精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1； 1∶500，Cell Signaling Technology)及抗CD11b(1∶400，Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜。次日PBS洗3次；加Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的II 抗(1∶500，Thermo Scientific)室溫孵育2 h，50%甘油封片，光鏡下觀察腦組織海馬及皮層區(qū)域AD病理標(biāo)志物，免疫陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度，用Image-Pro Plus軟件計(jì)數(shù)并求其均數(shù)。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 各組另外4只小鼠冰上快速取腦組織，用組織裂解液在4 ℃條件下裂解組織蛋白，并用BCA法測定蛋白含量，制備蛋白上樣緩沖液樣品，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白分離。電泳完畢后，用濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。膜置于5%脫脂牛奶封閉，加入抗Aβ1-42(1∶500)、抗p-Tau(1∶500)、抗BACE(1∶500)、 抗ROCK-II(1∶500)、抗TLR-4(1∶500)、抗p-NF-κB(1∶500)、抗iNOS(1∶500)、抗Arg-1(1∶500)、抗β-actin(1∶500，Epitomics)、抗GAPDH(1∶500，Epitomics)及相應(yīng)的HRP偶聯(lián) II 抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology)。使用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測染色條帶強(qiáng)度，以檢測蛋白條帶與內(nèi)參照β-actin或GAPDH的吸光度(A)比值表示。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，3組組間比較采用ANOVA及Dunnett’s Post-Hoc檢驗(yàn)，2組比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1FSD-C10有效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的記憶能力障礙，為了檢測FSD-C10能否改善這種障礙，我們首先通過水迷宮實(shí)驗(yàn)對小鼠認(rèn)知功能進(jìn)行檢測。

定位航行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，野生組小鼠搜索平臺的潛伏期時(shí)間明顯低于模型組(P<0.05), 小鼠找到平臺所經(jīng)過的平均距離明顯低于模型組(P<0.01)，小鼠第1次入水到達(dá)平臺所在象限用的時(shí)間明顯少于模型組(P<0.01)，說明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的學(xué)習(xí)記憶能力的障礙。經(jīng)過持續(xù) 2 個(gè)月使用FSD-C10治療，與模型組比較，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組的搜索潛伏期明顯縮短(P<0.05)，找到平臺的平均距離(P<0.05)及第1次入水到平臺達(dá)象限的時(shí)間也明顯縮短(P<0.05)。

在空間探索實(shí)驗(yàn)中，小鼠在目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比和在目標(biāo)象限游滯留路程百分比干預(yù)組均高于模型組小鼠(P<0.05)，而3組相比較動(dòng)物肢體運(yùn)動(dòng)功能變化的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，可排除肢體功能對運(yùn)動(dòng)的影響。結(jié)果表明經(jīng)FSD-C10干預(yù)有效改善了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，見圖1。

2FSD-C10減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1-42沉積、p-Tau生成和BACE蛋白表達(dá)

Aβ1-42免疫組化染色結(jié)果顯示，APP/PS1模型組和FSD-C10干預(yù)組的海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)均有Aβ1-42的陽性表達(dá)，模型組小鼠腦內(nèi)海馬DG區(qū)Aβ1-42的陽性表達(dá)數(shù)量多、體積大，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組小鼠腦內(nèi)海馬DG區(qū)Aβ1-42的陽性表達(dá)數(shù)量少、體積小，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。而野生組小鼠海馬DG區(qū)未見明顯Aβ陽性反應(yīng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組和野生組小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積水平均低于模型組(P<0.01)。

觀察p-Tau蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，模型組和FSD-C10干預(yù)組的海馬區(qū)均有p-Tau 的陽性表達(dá)，與模型組比較，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組小鼠海馬區(qū)p-Tau 蛋白的陽性數(shù)量明顯減少(P<0.01)。 而野生組小鼠海馬區(qū)未見明顯p-Tau 蛋白陽性表達(dá)。Western blot分析結(jié)果顯示，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組和野生組小鼠腦內(nèi)的p-Tau 蛋白水平均低于模型組。

Figure 1. FSD-C10 improved spatial learning ofAPP/PS1 double transgenic mice analyzed by Morris water maze test. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖13組小鼠水迷宮測試認(rèn)知功能6項(xiàng)指標(biāo)的比較

BACE 蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，與野生組比較，模型組小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)域BACE蛋白的陽性數(shù)明顯增加，與模型組比較，F(xiàn)SD-C10干預(yù)明顯減少BACE蛋白表達(dá)(P<0.01)。 Western blot計(jì)量結(jié)果顯示，與模型組相比，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組小鼠腦內(nèi)的BACE蛋白水平明顯降低(P<0.01)，但尚未達(dá)到野生組的水平，見圖2。

3FSD-C10抑制APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織炎癥微環(huán)境

炎癥反應(yīng)在AD病理過程中發(fā)揮著重要的作用，我們通過免疫組化和Western blot技術(shù)檢測小鼠腦內(nèi)海馬和皮層區(qū)TLRs/NF-κB炎癥信號通路相關(guān)因子的表達(dá)。

免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠炎癥因子TLR-4和p-NF-κB的陽性細(xì)胞數(shù)增多，在小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)和皮質(zhì)部位均有明顯的表達(dá)，而FSD-C10干預(yù)組TLR-4和p-NF-κB的蛋白水平明顯減少，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR-4和p-NF-κB在各組的表達(dá)趨勢與免疫組化結(jié)果一致，與模型組相比，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組小鼠腦內(nèi)TLR-4和p-NF-κB的蛋白水平明顯低于模型組(P<0.05 和P<0.01)；FSD-C10干預(yù)組小鼠ROCK-II的表達(dá)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化和Western blot兩種實(shí)驗(yàn)方法從定位和定量兩方面證明，F(xiàn)SD-C10干預(yù)可抑制APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠TLRs/NF-κB炎癥信號通路的激活，改善炎癥微環(huán)境，減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，見圖3。

Figure 2. FSD-C10 attenuated Aβ1-42deposition， Tau phosphorylation and BACE expression in theAPP/PS1 double transgenic mice. A: representative photomicrographs and quantitative analysis of Aβ1-42, p-Tau and BACE protein expression in dentate gyrus area of mouse hippocampus observed by immunohistochemical staining; B: the protein levels of Aβ1-42, p-Tau and BACE determined by Western blot. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsmodel group.

圖23組小鼠病理標(biāo)志物Aβ1-42、p-Tau和BACE免疫組化染色和Westernblot檢測結(jié)果的比較

Figure 3. FSD-C10 inhibited inflammatory microenvironment in theAPP/PS1 double transgenic mice. A: representative photomicrographs and quantitative analysis of TLR-4 and p-NF-κB in the hippocampus and cortex of the mice observed by immunohistochemical staining; B: the protein levels of ROCK-II, TLR-4 and p-NF-κB in the brain determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖3AD模型組與FSD-C10治療組小鼠TLRs/NF-κB炎癥信號通路免疫組化染色和Westernblot檢測結(jié)果的比較

4FSD-C10抑制APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織iNOS的表達(dá)和增加Arg-1的表達(dá)

小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是 AD 炎癥反應(yīng)中最主要的炎癥細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞根據(jù)功能狀態(tài)不同分為M1型和M2型。我們進(jìn)一步通過免疫組化和Western blot技術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞極化的變化。

iNOS為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，Arg-1為M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，F(xiàn)SD-C10干預(yù)組小鼠海馬區(qū)iNOS陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，而Arg-1蛋白陽性的細(xì)胞數(shù)則增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iNOS和Arg-1在各組的表達(dá)趨勢與免疫組化結(jié)果一致，F(xiàn)SD-C10 干預(yù)組iNOS的表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01)，而Arg-1表達(dá)則顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)果提示FSD-C10可抑制iNOS表達(dá)，增加Arg-1表達(dá)，具有使M1型炎性小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型抗炎性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效能，起到抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，見圖4。

Figure 4. FSD-C10 inhibited the expression of iNOS and increased the expression of Arg-1. A: the double staining of CD11b (green) and iNOS/Arg-1 (red) by immunohistochemical observation; B: representative bands and quantitative analysis of Western blot for determining iNOS and Arg-1. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖4AD模型組與FSD-C10治療組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色和Westernblot檢測結(jié)果的比較

討 論

到目前為止，AD發(fā)病的機(jī)理仍然不清楚，主要學(xué)說包括膽堿能學(xué)說、β淀粉樣蛋白瀑布學(xué)說、Tau蛋白假說、神經(jīng)血管學(xué)說和氧化應(yīng)激學(xué)說等，許多基因、細(xì)胞和分子的異常使得該病機(jī)制更為復(fù)雜，治療更為困難，就目前對AD的認(rèn)識程度，用于治療AD并已獲美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)的藥物包括膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊)、NMDA受體拮抗劑(美金剛)等[6]。這些藥物只能緩解AD癥狀，但不能影響疾病的進(jìn)展。

ROCK的異常激活可見于AD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍X組織中，推測可能參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示抑制ROCK可增加海馬錐體神經(jīng)元突觸密度和長度，改善空間學(xué)習(xí)和記憶[7]。最近研究證實(shí)抑制ROCK可減少Aβ產(chǎn)生, 增加可溶性APP或單體Aβ[8-9]。因此，ROCK抑制劑成為AD防治的潛在藥物靶點(diǎn)。我們的前期研究證實(shí)ROCK抑制劑Fasudil對AD小鼠具有較好的治療效果，新型ROCK抑制劑FSD-C10，其效價(jià)與Fasudil等同，但對神經(jīng)元毒性小、對血管影響小，安全窗相對較大。本研究試圖觀察FSD-C10干預(yù)對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的治療效果，并探討可能的細(xì)胞分子機(jī)制。

Aβ沉積引起的老年斑及過磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的2個(gè)特征性病理改變[10]。BACE蛋白是調(diào)節(jié)Aβ生成的酶。其中Aβ是AD的核心致病物質(zhì)，具有很強(qiáng)的自聚性，只要形成聚集體，就能表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性[11]。本研究結(jié)果顯示FSD-C10干預(yù)明顯提高APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有效減少APP/PS1小鼠海馬區(qū)AD的病理標(biāo)志物Aβ沉積，抑制Tau蛋白磷酸化和BACE蛋白表達(dá)，說明FSD-C10具有成為治療AD的潛能。Aβ在AD早期發(fā)揮啟動(dòng)致病的作用，一旦AD病程啟動(dòng)，Aβ在腦內(nèi)特定區(qū)域聚集，使腦內(nèi)的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并增殖，并過量釋放NO、TNF-α、IL-6 等促炎因子，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷，觸發(fā)免疫炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12]。大量炎癥介質(zhì)和炎癥因子的釋放使得中樞神經(jīng)組織處在長期的炎癥微環(huán)境中，可以造成神經(jīng)突觸損傷，線粒體功能障礙，神經(jīng)元變性死亡[13]。已有多項(xiàng)研究認(rèn)為膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥機(jī)制可能參與AD神經(jīng)元變性的過程[14]。

TLRs/NF-κB信號通路激活所引起的炎性反應(yīng)可能是AD發(fā)病中炎癥損傷的一種重要機(jī)制。在AD病理進(jìn)展中，Aβ沉積可引起TLR4表達(dá)增加，并且誘導(dǎo)NF-κB激活，從而促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放，進(jìn)一步加重組織損傷[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)FSD-C10干預(yù)抑制TLRs/NF-κB炎癥通路激活，有效改善APP/PS1小鼠腦組織的炎癥微環(huán)境，從而減少對神經(jīng)元損傷。

MG作為腦內(nèi)常駐的免疫細(xì)胞，主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫和炎癥反應(yīng)，是 AD 炎癥反應(yīng)中最主要的炎癥細(xì)胞，介導(dǎo)并貫穿AD 病理發(fā)展全程[18-19]。AD患者大腦中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，特別是AD在Aβ沉積為老年斑的區(qū)域。應(yīng)用PK11195 PET掃描也發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)呈現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活成像。AD尸檢也發(fā)現(xiàn)患者腦內(nèi)伴有明顯小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，斑塊周圍有大量M1型小膠質(zhì)細(xì)胞。激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌諸多炎癥細(xì)胞因子和活性氧物質(zhì)，能夠引起神經(jīng)元的凋亡[20]。小膠質(zhì)細(xì)胞根據(jù)功能狀態(tài)不同分為M1型和M2型，M1型可引起組織炎癥性損傷，M2型具有抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FSD-C10干預(yù)抑制APP/PS1小鼠iNOS表達(dá)，而增加Arg-1表達(dá)，提示FSD-C10可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化，形成一個(gè)有助于抑制炎性和神經(jīng)修復(fù)的微環(huán)境。

綜上所述，F(xiàn)SD-C10有效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極性，抑制炎癥反應(yīng)和改善炎癥微環(huán)境有關(guān)。我們的研究僅為AD的治療提供一個(gè)策略，有必要對FSD-C10治療AD的機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

突觸后突觸結(jié)合蛋白在長時(shí)程增強(qiáng)過程中介導(dǎo)AMPA受體的胞吐作用

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體依賴性長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)引起的突觸聯(lián)系增強(qiáng)具有重塑神經(jīng)環(huán)路及調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶的作用。在NMDA受體依賴性LTP誘導(dǎo)過程中，Ca2+內(nèi)流會刺激突觸α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid, AMPA)受體的募集，從而強(qiáng)化突觸聯(lián)系。然而，Ca2+誘導(dǎo)AMPK受體募集的機(jī)制尚未明確。Wu等的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元中同時(shí)阻斷突觸結(jié)合蛋白1(synaptotagmin-1, Syt1)和突觸結(jié)合蛋白7(synaptotagmin-7, Syt7)的突觸后表達(dá)可拮抗LTP，但單獨(dú)阻斷其中一個(gè)蛋白則無此作用。野生型Syt7的表達(dá)可恢復(fù)LTP，而Ca2+結(jié)合缺失突變型Syt7則不會有這種作用。阻斷Syt1和Syt7的突觸后表達(dá)不會阻礙突觸的基礎(chǔ)傳遞，不減少突觸或突觸外的AMPA受體水平，也不會改變其他AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)。此外，負(fù)顯性突變Syt1(抑制Ca2+依賴性突觸前囊泡的胞吐作用)的表達(dá)同樣會阻斷Ca2+依賴性突觸后AMPA受體的胞吐作用，從而拮抗LTP。該研究結(jié)果表明，突觸后Syt1和Syt7在LTP過程的AMPA受體Ca2+依賴性胞吐作用中是額外的Ca2+感受器，從而闡釋了介導(dǎo)LTP的AMPA受體募集的一個(gè)簡單機(jī)制。

Neuron, 2017, 544(7650):316-321(李 偉)

EffectofFSD-C10onmodulationofinflammatorymicroenvironmentinanAlzheimerdiseasedoubletransgenicmousemodel

GU Qing-fang1, YU Jie-zhong1, WU Hao1, LI Yan-hua1, FAN Hui-jie2, CHAI Zhi2, WANG Qing2, XIAO Bao-guo1, 3, MA Cun-gen1, 2

(1InstituteofBrainScience,DatongUniversity,Datong037009,China;2"2011"CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China;3InstituteofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200025,China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM: To explore the therapeutic effect of a novel Rho kinase inhibitor FSD-C10 on β-amyloid protein precursor (APP)/presenilin-1 (PS1) double transgenic mice.METHODSThe transgenic mice overexpressing humanAPPwith the Swedish mutation (695) and humanPS1 with ΔE9 mutation at the age of 8 months were used in this study. The mice were randomly divided into model group and FSD-C10 intervention group, and wild-type mice at the same age served as normal controls. The mice in FSD-C10 intervention group were treated with FSD-C10 (25 mg·kg-1·d-1) for 2 months by intraperitoneal injection. The mice in model group and the wild-type mice were injected with saline in the similar manner. Morris water maze (MWM) test was applied to examine the capacity of learning and memory. The Aβ1-42deposition, Tau protein phosphorylation， and the expression of β-site APP-cleaving enzyme (BACE) as well as inflammatory molecules, such as TLR-4 and NF-κB, and M1/M2 microglial markers, such as iNOS and Arg-1, were determined by the methods of immunohistochemistry and Western blot.RESULTSCompared with model group, FSD-C10 significantly improved the learning and memory abilities ofAPP/PS1 double transgenic mice, accompanied by reduced Aβ1-42deposition, Tau protein phosphorylation and BACE expression in the hippocampus. The intervention of FSD-C10 decreased the protein levels of TLR-4 and p-NF-κB, reduced the expression of iNOS and increased the expression of Arg-1 in the brain tissues.CONCLUSIONThe novel Rho kinase inhibitor FSD-C10 improves the capacity of spatial learning and memory inAPP/PS1 double transgenic mice, which may be related to the inhibition of TLRs/NF-κB signaling pathway, the reduction of the secretion of inflammatory molecules and the polarization of anti-inflammatory M2 microglia, thus improving the inflammatory microenvironment of the brain inAPP/PS1 double transgenic mice.

APP/PS1 double transgenic mice; FSD-C10; Inflammatory microenvironment; TLRs/NF-κB pathway

R363； R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.001

1000- 4718(2017)10- 1729- 09

2017- 03- 27

2017- 07- 20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81471412； No. 81272163)；山西省國際科技合作項(xiàng)目(No. 2013081058)；山西中醫(yī)學(xué)院“2011”培育計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2011PY-1)；大同市科技局基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2017136； No. 2014105-1)；大同大學(xué)?？蒲许?xiàng)目(No. 2016K10)

△通訊作者 Tel: 0351-3179809； E-mail： macungen2001@163.com

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