脂肪干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及其治療下肢缺血性疾病的研究進(jìn)展

徐桂珍++簡雪平++眭云鵬++馬麗++劉燕平+文輝才

[摘要]下肢缺血性疾病是臨床常見的嚴(yán)重危害中老年人健康的疾病之一，目前治療方法多樣，一般采用藥物、血管搭橋、介入手術(shù)等方式，但遠(yuǎn)期療效較差，治療效果往往不甚理想。近年來，脂肪干細(xì)胞在治療下肢缺血性疾病方面的實(shí)驗(yàn)研究逐漸增多。本文擬就目前脂肪干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及其治療下肢缺血性疾病的研究現(xiàn)狀作一綜述，并對其存在的問題進(jìn)行分析及展望。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；下肢缺血；移植；分化

[中圖分類號(hào)]Q813.1 R654.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）09-0122-03

Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Endothelial Cells and their Transplantation for Hindlimb Ischemia

XU Gui-zhen，JIAN Xue-ping，SUI Yun-peng，MA Li，LIU Yan-ping，WEN Hui-cai

（Department of Plastic and Cosmetic Surgery，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，Jiangxi，China）

Abstract： Ischemicdiseaseoflowerextremityisaseverediseasethreateninghumanhealth.Treatmentforischemicdiseasecommonlyusedrugs， vascular bypass，interventional surgery， but the long-term effect is unsatisfied.Thisreview aimstosummarizethedifferentiation of adipose-derived stem cells into endothelial cells and their transplantation for Hindlimb Ischemia， and to analyze current problems and to prospect the future.

Key words：adipose-derivedstemcells； vascularendothelial cells； hindlimb ischemia； transplantation；differentiation

隨著社會(huì)的發(fā)展和人口老齡化進(jìn)程的加快，下肢缺血性疾病越來越困擾著中老年患者及其家人，已成為臨床上嚴(yán)重危害中老年人群體健康的常見疾病之一。目前，臨床針對下肢缺血性疾病的治療方法多樣，一般采用藥物、血管搭橋、介入手術(shù)等方式，但遠(yuǎn)期療效較差，對于肢體嚴(yán)重缺血的患者需要進(jìn)行截肢處理，因此治療效果往往不甚理想[1]。近年來，干細(xì)胞因其強(qiáng)大的多向分化能力和自我更新能力而不斷被研究，在臨床治療下肢缺血性疾病方面得到廣泛的應(yīng)用。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）不僅具有多向分化潛能和細(xì)胞因子分泌能力，更因其儲(chǔ)量豐富，獲取方便，免疫排斥反應(yīng)弱，無倫理限制等特性，干細(xì)胞移植治療展現(xiàn)了較好的臨床應(yīng)用前景，為下肢缺血患者帶來新的希望?，F(xiàn)將近年來ADSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究及其在下肢缺血性疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 ADSCs的生物學(xué)特性

ADSCs主要位于機(jī)體脂肪組織中，屬于一種中胚層來源間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)膠原酶消化、離心、培養(yǎng)后所得。ADSCs在人類和動(dòng)物體內(nèi)獲取方式不一樣，人ADSCs可由脂肪抽吸或外科手術(shù)切取的方式獲取，動(dòng)物ADSCs可由腹股溝脂肪、內(nèi)臟脂肪等部位獲取。ADSCs的活性同時(shí)受到取材部位、方式以及供者年齡等因素的影響，一定程度上存在差異。在下腹部和大腿內(nèi)側(cè)獲取的ADSCs其單位體積內(nèi)的數(shù)量最高[2]。隨著年齡增長，ADSCs老化程度更高，表現(xiàn)出増殖、分化及遷移能力的相應(yīng)降低[3]。

研究表明ADSCs在低血清或者無血清的條件下也能生長，并且其誘導(dǎo)潛能不受影響[4]。在低糖、低氧和低谷氨酸等條件下，ADSCs的濃度是骨髓中干細(xì)胞的100～300倍[5]。ADSCs的傳代培養(yǎng)平均倍增時(shí)間需要兩天，在10代左右仍然能保持穩(wěn)定的倍增率，且衰老和死亡的細(xì)胞比例出現(xiàn)的較少。以上說明ADSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞中易于培養(yǎng)和大量應(yīng)用的種子細(xì)胞。

ADSCs由于其形態(tài)上與骨髓來源干細(xì)胞相似，因此無法從形態(tài)學(xué)上將兩者進(jìn)行區(qū)分。目前ADSCs尚無特異的表面標(biāo)志物，ADSCs表面標(biāo)志物也略有差別，主要受ADSCs培養(yǎng)方式的不同、細(xì)胞使用代數(shù)的變換、流式和免疫學(xué)檢查使用抗體來源不一致等因素的影響[6]。最常用的是通過分化表型逆推的方式鑒定ADSCs，流式細(xì)胞儀來鑒定ADSCs。研究表明[7]，ADSCs陽性表達(dá)CD29、CD44、CD49、CD71、CD90、CDl05，Sca-1等抗原，陰性表達(dá)CD31、CD34、CD45等抗原，通過免疫標(biāo)志對細(xì)胞進(jìn)行有效篩選，可以得到較純的干細(xì)胞，有助于ADSCs的進(jìn)一步研究。

ADSCs可通過自身分泌或者旁分泌方式分泌抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等因子。研究證實(shí)，ADSCs在缺血、缺氧及損傷的條件下可促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、b型成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、基質(zhì)源性血管因子（SDF-1）、前列腺素E2（PGE2）等。Hao等[8]發(fā)現(xiàn)ADSCs可通過調(diào)節(jié)PGE2的表達(dá)影響巨噬細(xì)胞IL-10、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子的分泌，為損傷組織的再生及修復(fù)提供適宜的微環(huán)境。endprint

2 ADSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化

2.1 在體外ADSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化：ADSCs在條件培養(yǎng)基下可以向組織內(nèi)多種細(xì)胞分化，在局部微環(huán)境下ADSCs能誘導(dǎo)分化成為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及心肌細(xì)胞等。作為間充質(zhì)干細(xì)胞的一員，ADSCs具有跨胚層分化的潛能，可被誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

Miranville等[9]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低濃度血清的培養(yǎng)基中，表面ADSCs可分化為具有功能性的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，特異性表達(dá)CD31標(biāo)記物和第VIII因子相關(guān)抗原。Amos等[10]的報(bào)道表明，在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和外來剪切力的作用下，ADSCs重新排列，表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物、周細(xì)胞表面標(biāo)志物和血管干細(xì)胞相關(guān)分子；Volz等[11]研究證實(shí)，ADSCs與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，在表皮生長因子（EGF）、氫化可的松（Hydrocortisone）誘導(dǎo)下可向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。以上說明ADSCs經(jīng)過一定的環(huán)境誘導(dǎo)可向成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

2.2 在體內(nèi)ADSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷徙：近年來，ADSCs參與血管構(gòu)建過程，在許多研究中得到證實(shí)。此外，ADSCs被不斷應(yīng)用于移植治療各種難治性疾病，如糖尿病潰瘍、腦卒中、下肢缺血以及心肌梗死等，均表明ADSCs可改善缺血區(qū)域的供血和功能。新生血管生成主要包括兩階段，即血管發(fā)生和血管形成。血管發(fā)生主要是通過內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化、增殖、遷移，形成血管網(wǎng)，血管形成是在已經(jīng)成熟的血管床基礎(chǔ)上形成毛細(xì)血管。據(jù)此理論，學(xué)者們提出了治療性血管形成和治療性血管生成兩個(gè)概念，為提高細(xì)胞治療組織的存活率、治療組織缺血性疾病提升了理論層次。由于ADSCs自分泌和旁分泌的作用特點(diǎn)，其不僅可以治療血管形成，也可以治療血管新生。Fischer等[12]研究證實(shí)，在內(nèi)皮生長因子和外來剪切力的作用下，ADSCs可向成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。Altman等[13]報(bào)道表明，植入的ADSCs在局部微環(huán)境下可以向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。Borges等[14]將ADSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞共同移植，能有效構(gòu)建絨毛尿囊膜的微血管網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮ADSCs促進(jìn)血管生成的作用。總結(jié)歸納ADSCs促進(jìn)血管再生的機(jī)制可能為：①ADSCs自我分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞參與新生血管的形成；②ADSCs在損傷局部自身分泌以及調(diào)節(jié)周邊細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞活性因子，促進(jìn)局部血管新生，抑制細(xì)胞凋亡；③ADSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞協(xié)同作用，從而促進(jìn)血管新生。

3 ADSCs在下肢缺血中的應(yīng)用

ADSCs是一種具有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，相比于臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓來源干細(xì)胞，ADSCs具有儲(chǔ)量豐富，獲取方便，無免疫排斥反應(yīng)，不受醫(yī)學(xué)倫理問題束縛等優(yōu)點(diǎn)，其在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域被廣泛地研究。大量的研究證實(shí)，采用自體ADSCs移植治療缺血組織，可以促進(jìn)下肢缺血的恢復(fù)。

3.1 細(xì)胞治療：近年來研究證實(shí)[15]，自體或者異體ADSCs移植治療下肢缺血，其治療結(jié)果是有效的。ADSCs可分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與缺血下肢的微血管新生。在基因治療領(lǐng)域，導(dǎo)入的外源基因在ADSCs體內(nèi)能夠穩(wěn)定地表達(dá)，因此ADSCs可以作為目的基因的載體。近年來有報(bào)道介紹通過病毒介導(dǎo)VEGF、HGF等基因轉(zhuǎn)染，以及低氧預(yù)處理ADSCs，可以增強(qiáng)下肢缺血組織血管新生的能力。Shevchenko等[16]的研究用腺病毒介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)染ADSCs，其仍然保持了成脂、成骨的分化能力和粘附特性，血管生成素-1（Ang-I）基因的mRNA表達(dá)水平顯著增加，而成纖維細(xì)胞生長因子-1（FGF-1）、干細(xì)胞生長因子（HGF）的水平無明顯變化；將轉(zhuǎn)染后的ADSCs與人工基質(zhì)膠混合后植入小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)ADSCs能夠顯著促進(jìn)血管生成；用轉(zhuǎn)染后的ADSCs注射移植到小鼠缺血下肢肌肉內(nèi)，VEGF165在ADSCs中得到持續(xù)性的高表達(dá)，并且血流恢復(fù)速度明顯優(yōu)于未轉(zhuǎn)染組。

3.2 組織工程（微凝膠）：游離的ADSCs移植注射到動(dòng)物病灶區(qū)域，會(huì)出現(xiàn)大量流失和死亡現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞治療效率低、不穩(wěn)定、重復(fù)性差[17]。因此，在臨床治療研究領(lǐng)域，尋找到一種高效、可控的方法應(yīng)對以上問題顯得尤為重要。Lee等[18]將ADSCs與含有成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF2）的可降解緩釋凝膠共同注射到小鼠缺血下肢肌肉內(nèi)，在注射后第4周和12周進(jìn)行肌肉樣本分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合處理后細(xì)胞存活率、新生毛細(xì)血管數(shù)量和相關(guān)促血管生長因子的表達(dá)量顯著高于ADSCs懸液組和單純FGF2凝膠組。以上結(jié)果表明FGF2緩釋凝膠和ADSCs共同移植可提高干細(xì)胞移植到缺血區(qū)域的長期保留率和促血管再生能力。Li等[19]將ADSCs與可注射明膠微冰膠進(jìn)行體外預(yù)培養(yǎng)，其目的是促進(jìn)ADSCs間的相互作用形成3D微組織，積累大量細(xì)胞外基質(zhì)和活性因子。然后通過注射器定點(diǎn)注射使其聚集在治療區(qū)域，發(fā)現(xiàn)ADSCs可有效地應(yīng)對機(jī)體病灶區(qū)域缺血、炎癥等惡劣環(huán)境，并且3D微組織相當(dāng)于傳統(tǒng)游離細(xì)胞療法十分之一的間充質(zhì)干細(xì)胞的用量，就可使得患有下肢缺血性疾病的小鼠實(shí)現(xiàn)血管和肌肉組織再生，避免截肢的發(fā)生。該種可注射型可降解明膠微冰膠能與ADSCs相互作用，為ADSCs創(chuàng)造一個(gè)較好的微環(huán)境，使細(xì)胞在其中粘附、生長和增殖，減少細(xì)胞在缺血部位的死亡率和流失率，保證缺血局部有足夠的細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮治愈功能。Park等[20]通過3D培養(yǎng)法形成ADSCs球體混合基質(zhì)膠注射到大鼠缺血患肢皮下，ADSCs能持續(xù)性地分泌各種細(xì)胞生長因子，起到促進(jìn)患肢血管再生的作用，且治療效果優(yōu)于ADSCs懸液混合基質(zhì)膠注射組，該種方法不僅能促進(jìn)周圍血管生長，同時(shí)能有效的促進(jìn)內(nèi)部血管生成。

3.3 物理輔助及其他聯(lián)合治療：2015年P(guān)rochroka等[21]學(xué)者提出一種雞尾酒療法，在含有多種細(xì)胞因子的人脂肪干培養(yǎng)基中，采用ADSCs培養(yǎng)基提取物治療兔下肢缺血模型，研究表明治療組下肢肌肉血管密度顯著高于對照組，說明ADSCs在體內(nèi)局部缺血環(huán)境下分泌的多種細(xì)胞因子也可直接起到治療效果。2016年Yoshida等[22]報(bào)道使用ADSCs聯(lián)合帶蒂血管皮瓣治療大鼠下肢缺血模型的創(chuàng)面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在聯(lián)合治療組的效果較單純ADSCs治療組和單純帶蒂血管皮瓣治療組更好。Park等[23]提出使用ADSCs聯(lián)合微光照射治療小鼠下肢缺血，觀察到效果比單純注射更佳。endprint

以上研究顯示，通過改變ADSCs的培養(yǎng)方式，或者聯(lián)合其他治療方法，都能有效改善ADSCs治療下肢缺血的效果。

4 總結(jié)和展望

應(yīng)用ADSCs治療下肢缺血，是一項(xiàng)具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)療技術(shù)，可為一系列難治性疾病提供新的治療方向，引起了各國臨床醫(yī)師、科研工作者及患者的關(guān)注。無論是基礎(chǔ)研究還是臨床研究均證實(shí)了ADSCs移植治療下肢缺血性疾病的有效性。目前此技術(shù)的應(yīng)用仍處于起步階段，臨床研究大多是單中心小樣本報(bào)告病例總結(jié)式報(bào)告，未形成統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察時(shí)間短，樣本量少，說服力、科學(xué)性不強(qiáng)，未來亟待開展多中心前瞻性隨機(jī)對照研究。另，理論研究尚未不完善，其治療的安全性及有效性并沒有充分的數(shù)據(jù)可以證實(shí)，更多的研究依然是集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域。隨著研究的不斷深入，ADSCs移植治療下肢缺血的機(jī)制將會(huì)得到更全面、具體的解釋，同時(shí)也將為下肢缺血等難治性疾病的防治帶來更多思路和方法，能使更多患者受益。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Etsu，Suzuki，Daishi，et al.Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease[J].World J Cardiol，2015，7（8）：454-465.

[2]Gir P，Brown SA，Oni G，et al.Fat grafting： evidence-based review on autologous fat harvesting， processing， reinjection， and storage[J].Plast Reconstr Surg，2012，130（1）：249-258.

[3]Kawagishi-Hotta M，Hasegawa S，Igarashi T，et al.Enhancement of individual differences in proliferation and differentiation potentials of aged human adipose-derived stem cells[J].Regn Ther，2017，6：29-40.

[4]Song SY，Chung HM，Sung JH.The pivotal role of VEGF in adipose-derived-stem-cell-mediated regeneration[J].Expert Opin Biol Th，2010， 10（11）：1529-1537.

[5]Dhanasekaran M，Indumathi S，Poojitha R，et al.Plasticity and banking potential of cultured adipose tissue derived mesenchymal stem cells[J].Cell Tissue Bank，2013， 14（2）：303.

[6]袁?？?，秦金保，葉開創(chuàng)，等.脂肪干細(xì)胞治療下肢缺血的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15（28）：5598-5600.

[7]Li K，Gao J，Zhang Z，et al.Selection of donor site for fat grafting and cell isolation[J].Aesthet Plast Surg，2013，37（1）：153.

[8]Hao C，Shintani S，Shimizu Y，et al.Therapeutic angiogenesis by autologous adipose-derived regenerative cells： comparison with bone marrow mononuclear cells[J].Am J Physiol-Heart C，2014，307（6）： H869.

[9]Miranville A，Heeschen C，Sengenès C，et al.Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells[J].Circulation，2004，110（3）：349.

[10]Amos P J，Shang H，Bailey AM，et al.IFATS Collection： The Role of Human Adipose-Derived Stromal Cells in Inflammatory Microvascular Remodeling and Evidence of a Perivascular Phenotype[J].Stem Cells，2008，26（10）：2682.

[11]Volz A C， Huber B， Schwandt A M， et al. EGF and hydrocortisone as critical factors for the co-culture of adipogenic differentiated ASCs and endothelial cells[J]. Differentiation，2017， 95： 21-30.

[12]Fischer LJ，Mcilhenny S，Tulenko T，et al.Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells： Effects of endothelial cell growth supplement and shear force[J].J Surg Res，2009，152（1）：157-166.endprint

[13]Altman AM，Yan Y，Matthias N，et al.IFATS collection： Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model[J].Stem Cells，2009，27（1）：250.

[14]Borges J，Mueller MC，Padron NT，et al.Engineered adipose tissue supplied by functional microvessels[J].Tissue Eng，2004，9（6）：1263-1270.

[15]Sz?ke K，Brinchmann JE.Concise Review： Therapeutic Potential of Adipose Tissue-Derived Angiogenic Cells[J].Stem Cell Transl Med，2012，1（9）：658.

[16]Shevchenko EK， Makarevich PI，Tsokolaeva ZI，et al.Transplantation of modified human adipose derived stromal cells expressing VEGF165 results in more efficient angiogenic response in ischemic skeletal muscle[J].J Transl Med，2013，11（1）：138.

[17]Cheng AY， García AJ.Engineering the matrix microenvironment for cell delivery and engraftment for tissue repair[J].Curr Opin Bi，2013，24（5）：864.

[18]Lee TJ，Bhang SH，Yang HS，et al.Enhancement of long-term angiogenic efficacy of adipose stem cells by delivery of FGF2[J].Microvasc Res，2012，84（1）：1.

[19]Li Y，Liu W，Liu F，et al.Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia[J].P Natl Acad Sci USA，2014，111（37）： 13511-13516.

[20]In-Su P，Kang JA，Jungmi K，et al.Therapeutic effect of human adipose-derived stromal cells cluster in rat hind-limb ischemia[J].Anat Rec，2014，297（12）： 2289-2298.

[21]Procházka V，Jur?íková J，La??ák O，et al.Therapeutic Potential of Adipose-Derived Therapeutic Factor Concentrate for Treating Critical Limb Ischemia[J].Cell Transplan，2015，25（9）：1623-1633.

[22]Yoshida S，Yoshimoto H，Hirano A，et al.Wound Healing and Angiogenesis through Combined Use of a Vascularized Tissue Flap and Adipose-Derived Stem Cells in a Rat Hindlimb Irradiated Ischemia Model[J].Plast Reconstr Surg，2016，22（2）：1486-1497.

[23]Park IS，Chung PS，Ahn JC.Enhanced angiogenic effect of adipose-derived stromal cell spheroid with low-level light therapy in hind limb ischemia mice[J]. Biomaterial，2014，35（34）：9280-9289.

[收稿日期]2017-01-18 [修回日期]2017-07-16

編輯/張惠娟endprint