IPS細胞定向分化為造血干細胞關鍵技術的研究進展

曾憲卓+陳帥+王一飛+舒輝萍+張捷+滕嬌+李德智+莫建華

摘要：本文研究了誘導多能干細胞（IPS）分化為造血干細胞的能力。用小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9與人類IPS共培養(yǎng)，將IPS分化為造血干細胞，用流式細胞術檢測造血干細胞表面標志物的表達水平，實時熒光定量檢測分化過程中IPS與造血干細胞的基因表達水平的變化，用免疫磁珠法分離CD34+造血干細胞檢測細胞的集落形成能力。結(jié)果顯示：IPS與OP9細胞共培養(yǎng)誘導造血分化第四天IPS發(fā)生了變化，分化得到造血干細胞的表面標志物CD34。分化過程中多能性標志基因Oct4表達下降，造血轉(zhuǎn)錄因子表達升高，CD34的表達量逐漸升高，集落培養(yǎng)14天后得到紅系集落、粒系集落、巨核系集落等。從而得到結(jié)論通過將IPS細胞與OP9細胞共培養(yǎng)，可誘導IPS細胞分化為造血干細胞。

關鍵詞：IPS細胞；分化；造血干細胞

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植，則需要進行人體的白細胞抗原配型，否則發(fā)生免疫排異會危及患者生命?，F(xiàn)有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱，但數(shù)量供不應求，使其在疾病中的臨床應用中受到限制。隨著誘導性多能干細胞（IPS）提取技術的出現(xiàn)，使分化自身細胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報道如下：

1 材料和方法

1.1細胞株的來源

小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9購于美國ATCC，誘導性多能干細胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM，內(nèi)含20%的胎牛血清，OP9細胞誘導干細胞分化培養(yǎng)基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司?？贵w為APS-TRA-1-85，半固體培養(yǎng)基購于SCT公司。流式細胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進行細胞培養(yǎng)，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細胞的未分化狀態(tài)，OP9用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細胞培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細胞進行傳代培養(yǎng)4天后，將OP9的培養(yǎng)液換成誘導干細胞分化的培養(yǎng)液，將UC013細胞洗兩遍后，再對邊緣部位細胞進行消化，將細胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細胞后，將其轉(zhuǎn)移到加有分化培養(yǎng)液的細胞盤中搖勻，在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液，第四天開始每隔一天半換一次培養(yǎng)液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細胞，將細胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進行消化，制備單細胞懸液，再將細胞收集到離心管中進行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標記細胞，30秒后加入流式細胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細胞緩沖液重懸。將制備好的細胞懸液加入流式細胞儀進行分離，通過流式細胞儀分離柱的CD34-細胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細胞，即得到CD34+細胞。

用流式細胞術進行檢測，將共培養(yǎng)9天后的細胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細胞儀進行檢測。

集落形成實驗。將分選的CD34+細胞接種到半固體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，每孔接種1萬個細胞，培養(yǎng)14-16天。然后，在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細胞形成特征，對集落細胞進行分類和計數(shù)。同時，提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細胞中的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1細胞培養(yǎng)與觀察

觀察培養(yǎng)的細胞，結(jié)果顯示，對照組未分化的人體細胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實驗組培養(yǎng)2天后的細胞，表面布滿細胞集落，已進行造血干細胞分化。OP9細胞貼著細胞壁生長，細胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細胞排列規(guī)則，生長迅速，培養(yǎng)4天后細胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

2.2誘導造血干細胞分化

通過在本實驗組的誘導分化條件下，對實驗組和對照組細胞的培養(yǎng)，實驗組細胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細胞的形態(tài)也發(fā)生了分化，接著，OP9細胞開始出現(xiàn)老化跡象。

2.3流式細胞術檢測

共培養(yǎng)9天后用流式細胞儀檢測細胞造血表面標志物表達情況，用流式細胞儀分析培養(yǎng)細胞的CD34、CD43、CD31的表達情況，結(jié)果顯示表達上述表面標志物的細胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測

運用RT-PCR對共培養(yǎng)的細胞進行基因表達檢測，結(jié)果顯示，IPS細胞發(fā)生造血分化時，Oct-4基因的表達慢慢消失；造血轉(zhuǎn)錄因子基因表達緩慢升高；Runx-1基因在造血干細胞分化12天當中的表達呈波浪式變化，其中分化第二天表達量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達量逐漸增高。

2.5 CD34+細胞集落實驗

CD34+細胞在半固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，根據(jù)造血干細胞的形態(tài)特征，對細胞集落進行分類和計數(shù)。結(jié)果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、?！藓讼导洌–FU-GM）集落數(shù)量持續(xù)升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數(shù)量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細胞技術的發(fā)展，通過誘導分化得到造血干細胞已經(jīng)成為事實。相對于多能干細胞而言，IPS通過導入轉(zhuǎn)錄因子以及重編程進行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩(wěn)定，避免了胚胎干細胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應用于細胞替代性治療，并可以進行疾病的機理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細胞分化得到的造血干細胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。

在本文的研究中，沒有外加細胞因子，直接將IPS細胞誘導分化為造血干細胞，結(jié)果獲得了20%的CD34+細胞，即造血干細胞，CD34是表達于造血干細胞的表面標志物，表明IPS可以分化為造血干細胞，但是轉(zhuǎn)化率比較低。Runx1是調(diào)控造血干細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，期基因的表達量在分化過程中呈現(xiàn)波浪式的變化，Gata-2的表達則逐漸升高。體外分化得到的造血干細胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài)，說明IPS可以向各細胞系進行分化。

現(xiàn)在多能干細胞分化為造血干細胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進行誘導生成造血干細胞；二是基質(zhì)細胞與多能干細胞共培養(yǎng)；三是形成EB后與OP9進行共培養(yǎng)；四是單層誘導ESC生成造血干細胞。利用OP9細胞與胚胎干細胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境，為研究細胞定向分化為造血干細胞創(chuàng)造了可能性，OP9細胞主要支持早期的造血干細胞分化，并協(xié)助B淋巴細胞增殖?；|(zhì)細胞通過釋放的細胞因子支持造血干細胞的分化。這種誘導方法分化時間短，為臨床造血干細胞的移植提供了便利。誘導分化過程中不用添加細胞因子，比較經(jīng)濟。但該誘導方法也存在著一定的缺點，即存在鼠源性污染細胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應用。

目前臨床上移植造血干細胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細胞，而體外分化和擴增得到造血干細胞只能通過動物試驗來獲得。將造血干細胞植入重建小鼠體內(nèi)，可以評價造血干細胞的功能。體外分化獲得的造血干細胞和臍血中的造血干細胞與重建小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)差異較大，需要進一步優(yōu)化體外誘導多能干細胞分化為造血干細胞的過程，才能滿足該實驗需求

4 小結(jié)

通過將IPS定向分化為造血干細胞的研究，成功誘導了造血干細胞，分化得到的細胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術方法希望可以為IPS細胞在造血疾病中的應用提供一定的實驗依據(jù)。

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