P-選擇素基因S290N和P-選擇素糖蛋白配體-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死血小板白細(xì)胞聚集體的相關(guān)性探討

李　滔，李琳蕓，王昌富，梅　冰，姚長江，龔道凱，胡小輝

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P-選擇素基因S290N和P-選擇素糖蛋白配體-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死血小板白細(xì)胞聚集體的相關(guān)性探討

李滔，李琳蕓，王昌富，梅冰，姚長江，龔道凱，胡小輝

目的探討血小板白細(xì)胞聚集體在缺血性腦梗死中的變化以及與P-選擇素基因S290N和P-選擇素糖蛋白配體-1基因M62I多態(tài)性的關(guān)系。方法選取58例缺血性腦梗死患者作為病例組，20例正常人群作為對照組。病例組分為大動脈粥樣硬化性腦梗死(LAA)19例，小動脈閉塞性腦梗死(SAO)39例。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測所有受試者的血小板白細(xì)胞聚集體(PLA)、血小板單核細(xì)胞聚集體(PMA)、血小板淋巴細(xì)胞聚集體(PLyA)和血小板中性粒細(xì)胞聚集體(PNA)水平。并運(yùn)用基因測序方法檢測P-選擇素基因S290N和P-選擇素糖蛋白配體-1基因 M62I多態(tài)性。結(jié)果PMA%在病例組與對照組、LAA與對照組、SAO與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.018，P=0.000)。PNA%在病例組與對照組、LAA與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，P=0.002)。PNA%在LAA組SELP基因S290N位點(diǎn)SS和SN基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。PLA%在LAA組PSGL-1基因M62I位點(diǎn)MM、MI和Ⅱ基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)。結(jié)論P(yáng)MA和PNA與缺血性腦梗死發(fā)病有關(guān)，SELP基因S290N位點(diǎn)SN基因型以及PSGL-1基因M62I位點(diǎn)MM基因型會增加LAA發(fā)生風(fēng)險。

血小板單核細(xì)胞聚集體；血小板中性粒細(xì)胞聚集體；P-選擇素；P-選擇素糖蛋白配體-1；缺血性腦梗死；基因型

血小板和白細(xì)胞的功能在缺血性腦梗死的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[1]。血小板和白細(xì)胞分別活化后，其表面的黏附分子增加。黏附分子通過配體相互結(jié)合和(或)通過纖維蛋白原在黏附分子之間的橋接作用形成血小板白細(xì)胞聚集體[2,3](patelet leukocyte aggregation,PLA)。根據(jù)血小板與不同類別的白細(xì)胞結(jié)合,分別形成血小板單核細(xì)胞聚集體(platelet monocyte aggregations,PMA)、血小板淋巴細(xì)胞聚集體(platelet lymphocyte aggregations,PLA)和血小板中性粒細(xì)胞聚集體(platelet neutrophilic aggregations,PNA)。已有的臨床研究表明[4]，PLA尤其是PMA可以作為評價血小板活化的指標(biāo)。血小板活化后，血小板膜表面的P-選擇素表達(dá)增加。P-選擇素(P-selectin,SELP)即CD62P，是一種跨膜糖蛋白，主要存在于活化血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade小體[5]。伴隨著血小板活化，SELP迅速定位于活化血小板的表面。P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)，也是一種跨膜糖蛋白，其作為SELP的結(jié)合配體，幾乎表達(dá)于所有白細(xì)胞的表面[6]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，PSGL-1是唯一與SELP具有高親和力的配體，且抗PSGL-1單克隆抗體可以完全阻斷血流狀態(tài)下白細(xì)胞在表達(dá)SELP細(xì)胞上的滾動以及靜止?fàn)顟B(tài)下白細(xì)胞與表達(dá)SELP細(xì)胞的黏附[7]?；罨“蹇梢酝ㄟ^表面的SELP和白細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合形成PLA。SELP和PSGL-1存在基因多態(tài)性。有研究證實(shí)SELP基因多態(tài)性和PSGL-1基因多態(tài)性與缺血性腦梗死的發(fā)生可能有關(guān)[8～10]。而PLA的形成在缺血性腦梗死的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。我們研究旨在關(guān)注SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死患者PLA水平變化的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對象根據(jù)2013年美國心臟協(xié)會卒中委員會(AHA)/美國卒中協(xié)會(ASA)發(fā)布的21世紀(jì)腦梗死新定義的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，選取缺血性腦梗死患者58例作為病例組。男37例，女22例，平均年齡(62.67±12.67)歲。其中大動脈粥樣硬化性腦梗死(large artery atherosclerosis,LAA)19例，小動脈閉塞性腦梗死(small artery occlusion,SAO)39例。另外選取20例無高血壓、糖尿病、冠心病等心腦血管疾病的健康人群作為對照組。男11例，女9例，平均年齡(60.05±8.05)歲。

1.2研究方法

1.2.1流式細(xì)胞分析抽血時前2 ml血棄去，獲取枸櫞酸鈉抗凝全血標(biāo)本，立即處理。溫和顛倒混勻，取每管50 μl，共2管。(1)標(biāo)記抗體：每管如下加抗體：對照管加CD45-ECD5 μl，IgG1-PE10 μl。檢測管加CD45-ECD5 μl，CD42b-PE10 μl。溫和混勻，室溫避光孵育20 min。(2)溶血固定：加含1.5%甲醛的溶血劑OptiLyse 500 μl，溫和混勻，室溫放置10 min。(3)洗滌：加PBS 3 ml，混勻，室溫避光孵育5 min。1500 rpm離心5 min。去上清。適量PBS重懸沉淀，上機(jī)檢測。以CD45-ECD標(biāo)記所有的白細(xì)胞，以CD42b-PE標(biāo)記血小板，在CD45-ECD/SSC散點(diǎn)圖中顯示單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。分別圈定設(shè)門，以CD45-ECD/CD42b-PE雙陽性為PLA，計(jì)數(shù)至少1000個白細(xì)胞，分別記錄PLA、PMA、PLyA和PNA數(shù)量占白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)的百分比。所有熒光標(biāo)記單克隆抗體、OptiLyse溶血劑、Epics XL 流式細(xì)胞儀均來自于美國Beckman Coulter公司。

1.2.2基因測序分析采集受試者靜脈血2 ml于EDTA-K2抗凝管中，使用Takara Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒提取所有受試者基因組DNA。根據(jù)NCBI提供的Genebank庫中PSEL S290N和PSGL-1 M62I位點(diǎn)附近260 bp序列，運(yùn)用斯坦福大學(xué)在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，由Takara寶生物工程(大連)有限公司合成。PSEL S290N上游引物序列為：5’-GTGCAGACCAGTGTCCAGAGT-3’，下游引物序列為5’-CCTGCATTTCAGAGGTGGTT-3’。PSGL-1 M62I上游引物序列為：5’-CAGCTCCGTGGTCAGCTCT-3’，下游引物序列為5’-TGTGGGACACCTGGGCAGAT-3’?；蚪MDNA在ABI7300熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化和基因測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)(四分位間距)表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H(K)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在Windows 7 Service Pack 1操作系統(tǒng)中采用SPSS 18.0軟件處理。

2　結(jié)　果

2.1PLA%、PMA%、PLyA%、PNA%在病例組(和亞型組)與對照組間比較PMA%在病例組與對照組、LAA與對照組、SAO與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.018，P=0.000)。PNA%在病例組與對照組、LAA與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，P=0.002)(見表1)。

2.2對照組、LAA組和SAO組中PLA%、PMA%、PLyA%、PNA%與SELP基因S290N位點(diǎn)不同基因型和PSGL-1基因M62I位點(diǎn)不同基因型間的差異比較PNA%在LAA組SS和SN基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，SN基因型PNA%明顯增高。PLA%在LAA組MM、MI和II基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)，MM基因型PLA%明顯增高(見表2)。

2.3SELP基因S290N位點(diǎn)不同基因型以及PSGL-1基因M62I位點(diǎn)不同基因型中PLA%、PMA%、PLyA%、PNA%與對照組、LAA組和SAO組間的差異比較基因型為SN的受試者PNA%在對照組、LAA組和SAO組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)，LAA組PNA%明顯增高?；蛐蜑镸M的受試者PNA%在對照組、LAA組和SAO組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)，LAA組PNA%明顯增高(見表2)。

表1　PLA%、PMA%、PLyA%、PNA%在病例組(和亞型組)與對照組間比較

表2　以疾病亞型分組血小板白細(xì)胞聚集體水平在基因型間的比較和以基因型分組血小板白細(xì)胞聚集體水平在疾病亞型間的比較

注：*以疾病亞型分組血小板白細(xì)胞聚集體水平在基因型間的比較,**以基因型分組血小板白細(xì)胞聚集體水平在疾病亞型間的比較

3　討　論

在缺血性腦梗死發(fā)病早期，血小板迅速被活化，其α顆粒膜上SELP表達(dá)增加。SELP通過植物凝集素樣區(qū)域，與白細(xì)胞上表達(dá)的PSGL-1高親和力結(jié)合，形成PLA。大部分研究[2,12,13]指出PLA%在缺血性腦梗死中的水平顯著高于對照組。根據(jù)血小板與不同類別的白細(xì)胞結(jié)合，研究者還討論了PMA%、PLyA%和PNA%在病例組與對照組間的差異。Zeller[14]指出三者在病例組中均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而本實(shí)驗(yàn)中，除了PLyA%在病例組與對照組間差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，PMA%和PNA%在病例組中均高于對照組。這與Schmalbach[13]和Marquardt[15]報導(dǎo)的結(jié)果一致。而Tsai[16]的研究得出PMA%和PLyA%在病例組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PNA%在病例組與對照組間沒有差異。Oberheiden[17]僅僅只發(fā)現(xiàn)PMA%在病例組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按照病因?qū)W亞型分型得出，PMA%在亞型組與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PLyA%在亞型組與對照組間差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PNA%僅僅在LAA與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而LAA與SAO比較沒有發(fā)現(xiàn)三者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒于此，本文認(rèn)為PMA參與了大動脈粥樣硬化與小動脈玻璃樣變的形成，其作用程度可能強(qiáng)于PLyA和PNA。但PMA在大動脈粥樣硬化與小動脈玻璃樣變之間作用程度可能并無差異。

諸多研究結(jié)論不一，造成差異的原因不明。本文研究了SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多態(tài)性與缺血性腦梗死PLA水平的關(guān)系，試圖從缺血性腦梗死的遺傳學(xué)因素中找出原因。各基因型與PLA水平的關(guān)系探討中(以疾病亞型分組)，LAA組SELP基因S290N位點(diǎn)SN基因型患者PNA%水平高于SS基因型患者；LAA組PSGL-1基因M62I位點(diǎn)MM基因型患者PLA%水平高于MI和II基因型患者。各疾病亞型與PLA水平的關(guān)系探討中(以基因型分組)，SELP 基因S290N位SN基因型受試者，發(fā)生LAA的患者體內(nèi)PNA%水平高于發(fā)生SAO的患者和正常對照；PSGL-1基因 M62I位點(diǎn)MM基因型受試者，發(fā)生LAA的患者體內(nèi)PNA%水平高于發(fā)生SAO的患者和正常對照。由此可見，PNA在SELP基因S290N位點(diǎn)SN基因型和PSGL-1基因M62I 位點(diǎn)MM基因型患者中發(fā)生LAA的形成過程中發(fā)揮了重要作用。SELP基因S290N位點(diǎn)位于編碼第3個補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白樣功能區(qū)[18]，其多態(tài)性可能會影響SELP基因的轉(zhuǎn)錄和SELP水平的表達(dá)。PSGL-1 M62I位點(diǎn)靠近編碼SELP結(jié)合綁定的區(qū)域[19]，其多態(tài)性可能與SELP和PSGL-1相互作用的能力相關(guān)。在LAA形成過程中，SN基因型(NN基因型未檢出)患者以及MM基因型患者血小板膜上表達(dá)的SELP和白細(xì)胞膜上表達(dá)的PSGL-1促使PNA的形成更加緊密，結(jié)合的量更多，從而加速血管內(nèi)皮細(xì)胞附壁，單核細(xì)胞遷移，泡沫細(xì)胞形成，內(nèi)膜增厚，最終導(dǎo)致LAA。關(guān)于基因多態(tài)性與缺血性腦梗死PLA水平的關(guān)系探討，目前研究極少。Schmalbach[13]報導(dǎo)了PSGL-1 M62I可以作為缺血性腦梗死PLA相關(guān)的候選基因多態(tài)性位點(diǎn)，這與本文的結(jié)果一致。另外Lozano[20]報導(dǎo)PSGL-1基因數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多態(tài)性會影響PNA的結(jié)合能力。

總之，目前的研究表明缺血性腦梗死患者PMA%和PNA%急速升高。LAA組PMA%和PNA%，SAO組PMA%高于對照組。SELP 基因S290N多態(tài)性與LAA組PNA%相關(guān)，SN基因型會增加LAA發(fā)生風(fēng)險。PSGL-1基因M62I多態(tài)性與LAA組PLA%相關(guān)，MM基因型會增加LAA發(fā)生風(fēng)險。

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Association of polymorphism of P-selectin gene S290N and P-selectin glycoprotein ligand-1 gene M62I with platelet leukocyte aggregation in ischemic cerebral infarction

LITao,LILinyun,WANGChangfu,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedJingzhouHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Jingzhou434020,China)

ObjectiveTo investigate the association of polymorphism of P-selectin (SELP) gene S290N and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) gene M62I with platelet leukocyte aggregation in ischemic cerebral infarction.MethodsA total of 58 ischemic cerebral infarction patients including 19 large artery atherosclerosis cerebral infarction (LAA) patients and 39 small artery occlusion cerebral infarction (SAO) patients and 20 healthy controls were enrolled into the study.The levels of platelet leukocyte aggregation (PLA),platelet monocyte aggregations (PMA),platelet lymphocyte aggregations (PLyA) and platelet neutrophilic aggregations (PNA) were detected by flow cytometric analysis and the polymorphisms of SELP gene S290N and PSGL-1 gene M62I were detected by gene sequencing.ResultsThe percentages of PMA were significant differences between the cases group and the controls group,the LAA group and the controls group,the SAO group and the controls group(P=0.000,P=0.018,P=0.000,respectively).The percentages of PNA were significant differences between the cases group and the controls group,the LAA group and the controls group(P=0.045,P=0.002,respectively).The percentages of PNA were significant differences between SS and SN genotypes of SELP gene S290N in the LAA group(P=0.008) and the percentages of PLA were significant differences among MM,MI and II genotypes of PSGL-1 gene M62I in the LAA group(P=0.046).ConclusionPMA and PNA are correlated with ischemic cerebral infarction.The genotypes of SN in SELP S290N and MM in PSGL-1 M62I can increase the risk of large artery atherosclerosis cerebral infarction.

Platelet monocyte aggregations;Platelet neutrophilic aggregations;P-selectin;P-selectin glycoprotein ligand-1;Ischemic cerebral infarction;Genotype

1003-2754(2016)02-0113-04

2015-10-24；

2015-11-29

湖北省衛(wèi)計(jì)委基金項(xiàng)目(No.JX5B47)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，湖北 荊州 434020)

王昌富，E-mail：jzyyjyk@sina.com

R743.3

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