藥食合用對圍絕經(jīng)期綜合征模型大鼠神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)細胞凋亡及ER表達的影響

宋雨菊　桑鋒

[摘要] 目的 觀察更年滋腎湯合玉女酥對雌性去勢大鼠下丘腦、垂體、子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡及ER表達的影響，從神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)探討藥食合用治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機制。方法 采取雙側(cè)卵巢切除法建立圍絕經(jīng)期綜合征大鼠模型，2015年10月—2016年4月，選取上海斯萊克實驗動物中心健康、12周齡、雌性未孕SD大鼠60只，隨機分為正常對照組、模型組、中藥（更年滋腎湯）組、食療（玉女酥）組、藥食合用組，每組12只。給藥（食）6周后，處死大鼠取丘腦、垂體、子宮、胸腺、脾臟組織，檢測如下指標(biāo)：TUNEL方法檢測細胞凋亡率； Western blot技術(shù)檢測ERα蛋白的表達變化；Real time PCR方法檢測ERα mRNA的表達變化。 結(jié)果 ①細胞凋亡率變化：下丘腦、垂體各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組子宮（13.12±0.066）明顯高于對照組（3.28±0.075），中藥組（6.35±0.038）、藥食合用組（4.90±0.034）明顯低于模型組；模型組胸腺（3.46±0.215）明顯高于對照組（1.70±0.045），中藥組（2.51±0.038）、藥食合用組（2.18±0.034）明顯低于模型組；模型組脾臟（4.05±0.205）明顯高于對照組，中藥組（2.15±0.115）、藥食合用組（1.64±0.082）明顯低于模型組；差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。②ERα蛋白表達變化：各組織模型組明顯低于正常組（P<0.05）；除胸腺外，其他組織中藥組、藥食合用組均明顯高于模型組（P<0.05，P<0.01）。③ERα mRNA表達變化：模型組垂體（0.210±0.012）、下丘腦（0.197±0.015）、子宮（0.168±0.016）、脾臟（0.137±0.016）明顯低于對照組（P<0.05）；中藥組垂體（0.458±0.026）、下丘腦（0.410±0.028）、子宮（0.367±0.037）、脾臟（0.301±0.025）高于模型組（P<0.05）；食療組子宮（0.349±0.021）、脾臟（0.282±0.018）高于模型組（P<0.05）；藥食合用組垂體（0.523±0.025）、下丘腦（0.488±0.024）、子宮（0.743±0.042）、脾臟（0.723±0.069）高于模型組（P<0.05）。結(jié)論 藥食合用（更年滋腎湯合玉女酥）可通過影響雌性去勢大鼠下丘腦、垂體、子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡及ER表達，調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)，從而改善圍絕經(jīng)期綜合征。

[關(guān)鍵詞] 圍絕經(jīng)期綜合征；神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)；藥食合用

[中圖分類號] R285 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）08（a）-0022-04

[Abstracts] Objective This paper tries to observe the effect of Gengnianzishen Decoction and Yunv crisp on the apoptosis and the expression of ER of hypothalamus， pituitary， uterus， thymus， spleen of ovariectomized female rat， and explore the mechanism of drug-food combination in the treatment of peri menopausal syndrome from the neuroendocrine immune network. Methods The bilateral ovariectomy was used to establish the perimenopausal syndrome rat model. 60 health， 12 week old female SD rats from October 2015 to April 2016 were selected from Shanghai SLRC Animal Laboratory Center， and were randomly divided into the control group， model group， Chinese medicine （Gengnianzishen Decoction） group， diet therapy （Yunv crisp） group and drug-food combination group， with 12 cases in each group. After treating drugs （food） for continuous 6 weeks， the rats were killed and their hypothalamus， pituitary， uterus， thymus， spleen were taken out and used to detect the following indicators： the cell apoptosis rate was detected by TUNEL method； the expression of ER alpha protein by Western blot； expression of ER alpha mRNA by Real time PCR. Results ①The apoptosis rate changes： there was no significant difference in hypothalamus and pituitary between the groups； the uterus of model group was （13.12±0.066） significantly higher than the control group of （3.28±0.075）， Chinese medicine group of （6.35±0.038）， drug-food combination group of （4.90±0.034）， significantly lower than that of model group； the thymus of the model group was （3.46±0.215）， significantly higher than the control group of （1.70±0.045）， Chinese medicine group of （2.51±0.038）， drug-food combination group of （2.18±0.034）， significantly higher than that of model group； the spleen of the model group was （4.05±0.205）， significantly higher than the control group， Chinese medicine group was （2.15±0.115）， drug-food combination group of （1.64±0.082）， significantly higher than that of model group （P<0.01，P<0.05）. ②Expression of ER alpha protein： the model group decreased more significantly than the control group （P<0.05）； except for the thymus， Chinese medicine group， food and drug combination group were increased significantly than the model group （P<0.05， P<0.01）. ③expression of ER alpha mRNA： hypothalamus was （0.197±0.015）， pituitary was （0.210±0.012）， uterus was （0.168±0.016）， spleen was （0.137±0.016） of the model group， decreased significantly than the control group （P<0.05）； hypothalamus was （0.410±0.028）， pituitary was （0.458±0.026）， uterus was （0.367±0.037）， spleen was （0.301±0.025） of the Chinese medicine group， increased significantly compared with the model group （P<0.05）； The uterus （0.349±0.021） and spleen （0.282±0.018） were higher than the mooled grap（P<0.05） hypothalamus was （0.488±0.024）， pituitary was （0.523±0.025）， uterus was （0.743±0.042）， spleen was （0.723±0.069） of the food and drug combination group， increased significantly compared with the model group （P<0.05）. Conclusion The combination of medicine and food （Gengnianzishen Decoction and Yunv crisp） can affect the apoptosis and expression of ER in hypothalamus， pituitary， uterus， thymus， spleen of ovariectomized female rat， regulating network in rats with perimenopausal syndrome， so as to improve perimenopausal syndrome.endprint

[Key words] Perimenopausal syndrome； Neuroendocrine immune network； Drug-food combination

圍絕經(jīng)期綜合征在圍絕經(jīng)期婦女發(fā)病率80%以上，其中有25%的婦女癥狀嚴(yán)重，極大地影響了其身心健康、工作和家庭生活質(zhì)量[1-3]。近年來，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)已成為圍絕經(jīng)期綜合征發(fā)病機制研究的熱點。中醫(yī)藥治療圍絕經(jīng)期綜合征有著數(shù)千年歷史，并且以療效好、不良反應(yīng)小有著獨特優(yōu)勢[4]。多數(shù)醫(yī)家認為該病主要臨床癥狀皆源于腎虛，腎虛乃該病之主要病機，治法以補腎為根本。2015年10月—2016年4月，該研究選取上海斯萊克實驗動物中心健康、12周齡、雌性未孕SD大鼠60只，該研究選擇治療圍絕經(jīng)期綜合征的中醫(yī)經(jīng)驗方更年滋腎湯，結(jié)合食療古方玉女酥，觀察藥食同用對雌性去勢大鼠下丘腦、垂體、子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡及雌激素受體（ER）表達的影響，從神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)探討藥食合用治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機制，為圍絕經(jīng)期綜合征的預(yù)防、治療及康復(fù)提供客觀依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

清潔級健康SD大鼠60只，體重（250±10）g，雌性，由上海斯萊克實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物房，室溫18～22℃，相對濕度65%。更年滋腎湯藥物及其水煎劑均由北京同仁堂提供。玉女酥充分拌勻后混入鼠飼料中 （其中玉女酥占50%）。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒，由南京凱基生物工程有限公司提供。ERα抗體，購自美國santa Cruze公司；β-actin抗體，購自德國Calbiochem公司；羊抗兔IgG，購自美國Sigma公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購于大連寶生物工程有限公司。

1.2 造模與分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以3.5%水合氯醛溶液麻醉大鼠，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。第6天開始采用陰道涂片法觀察動情周期，陰道脫落細胞角化指數(shù)<50%且無動情周期性變化（符合更年期特征）者，為造模成功大鼠。對照組大鼠手術(shù)暴露卵巢但不切除。大鼠分為對照組、模型組、中藥組、食療組、藥食合用組，對照組和模型組灌胃生理鹽水，食療組按正常食量喂以含玉女酥的飼料，中藥組灌胃更年滋腎湯水煎液，藥食合用組用更年滋腎湯灌胃的同時喂以含玉女酥的飼料，連續(xù)給藥（食）6周后，禁食取材。

1.3 指標(biāo)檢測

大鼠處死后，立即取出下丘腦、垂體、子宮、胸腺、脾臟，TUNEL細胞凋亡試劑盒檢測各組織細胞凋亡率，Western Blot技術(shù)檢測各組織ERα蛋白的相對表達量，Realtime PCR技術(shù)檢測各組織ERα mRNA表達量。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠垂體、下丘腦、子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡率變化

結(jié)果顯示，垂體、下丘腦細胞凋亡率各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與正常組比較，模型組大鼠子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡率顯著升高 （P<0.01）；與模型組比較，中藥組、藥食合用組子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），藥食合用組尤為明顯。見表1。

2.2 各組大鼠垂體、下丘腦、子宮、胸腺、脾臟ERα蛋白水平變化

結(jié)果顯示，各組織模型組明顯低于正常組（P<0.05）；除胸腺外，其他組織中藥組、藥食合用組均明顯高于模型組（P<0.05，P<0.01）。見圖1。

2.3 各組大鼠垂體、下丘腦、子宮、胸腺、脾臟ERα mRNA水平變化

結(jié)果顯示，除胸腺外，其他組織模型組明顯低于對照組（P<0.05），各用藥組均高于模型組，部分臟器差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

中醫(yī)認為，婦女在圍絕經(jīng)期，腎氣漸衰，天癸將竭，沖任二脈隨之虧虛，腎虛是圍絕經(jīng)期綜合征的根本病機，治當(dāng)補益腎氣，然既不能單純溫腎助陽，也不可一味滋陰瀉火，而應(yīng)陰陽雙調(diào)，“溫腎補陽、滋陰降火”并用，使腎之陰陽趨于平衡[5-7]。更年滋腎湯由仙茅、仙靈脾、巴戟天、炒黃柏、炒知母、補骨脂、當(dāng)歸、制附子、生熟地、炙升麻、制黃精、炒棗仁組成，諸藥合用，陰中求陽、陽中求陰，最終達到溫補腎陽、滋陰降火的目的。玉女酥出于清代“玉女補乳酥”，由黃豆、花生、紅棗等量組成。食療與藥物治療相結(jié)合，相得益彰，藥借食威，食助藥力，藥食合用可發(fā)揮更好的效果，以藥食同用的方法防治疾病，是中醫(yī)學(xué)的突出特色之一。

胸腺、脾臟是機體主要免疫器官，以往研究已證實，性激素對免疫細胞凋亡有調(diào)節(jié)作用，而生理水平的雌激素則可保護免疫細胞免于凋亡[8]。楊琳[9]研究發(fā)現(xiàn)，二仙湯及其拆方均可抑制卵泡顆粒細胞的調(diào)亡，其機制與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase表達水平相關(guān)[9]。該研究發(fā)現(xiàn)去勢大鼠子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡率明顯升高，藥物干預(yù)后，中藥組、食療組、藥食合用組細胞凋亡率明顯降低，且藥食合用組降低尤為明顯。當(dāng)雌激素減少時，這些組織和器官就會發(fā)生退行性病變或代謝改變，導(dǎo)致圍絕經(jīng)期婦女在精神、心理和神經(jīng)內(nèi)分泌等多個系統(tǒng)出現(xiàn)不平衡。唐苾芯等[10]研究發(fā)現(xiàn)，滋陰補腎方可明顯提高血清雌激素水平，并對外周血單個核細胞中雌激素α受體（ERα）水平及其與雌激素β受體 （ERβ）的比值有顯著影響。張帆等[11-12]研究表明，自擬更年湯治療圍絕經(jīng)期綜合征腎陽虛證可能與提高下丘腦ER表達、促進卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育、抑制卵巢顆粒細胞及腎上腺皮質(zhì)Bax蛋白表達水平有關(guān)。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠去勢以后，ERα蛋白及mRNA表達明顯降低，藥物治療后，中藥組、藥食合用組子宮和脾臟細胞ERα表達水平有顯著升高，提示其可以在一定程度上改善去勢大鼠子宮、脾臟的ERα表達水平。endprint

綜上所述，藥食合用治療疾病是中醫(yī)學(xué)的一個突出特點?！八幨惩础薄搬t(yī)食同源”，食品用在妙處，確有藥品之功，每種療效食物中所含的營養(yǎng)素是其產(chǎn)生藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。診病之后，“藥以祛之，食以隨之”，對于圍絕經(jīng)期綜合征采用食療與藥物治療相結(jié)合，相得益彰，藥借食威，食助藥力，藥食合用可發(fā)揮更好的效果。該研究結(jié)果表明更年滋腎湯合玉女酥可通過影響雌性去勢大鼠下丘腦、垂體、子宮、胸腺、脾臟細胞凋亡及ER表達，增強E-ER生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)，從而改善圍絕經(jīng)期綜合征，但確切的作用過程尚需進一步驗證。

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（收稿日期：2017-05-06）endprint