右美托咪定對膿毒癥患者炎癥相關基因表達的影響

任德才，林名瑞，肖雄箭，林建東

--論著--

右美托咪定對膿毒癥患者炎癥相關基因表達的影響

任德才1，林名瑞2，肖雄箭3，林建東3

（1.平潭綜合實驗區(qū)醫(yī)院ICU，福建 福州 350400；2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院ICU，福建 福州 350004；3.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院ICU，福建 福州 350005）

目的 基于PCR Assay芯片技術，分析右美托咪定對膿毒癥患者炎癥相關基因表達的變化并推論其可能的作用機制。方法 選取本院2015年1月～2015年12月收治的50個老年嚴重膿毒癥病例，隨機分為右美托咪定治療組與生理鹽水對照組（常規(guī)治療組）。右美托咪定干預前與干預后1、3天所有患者靜脈采血立即提取RNA做PCR Assay基因芯片檢測。結果 右美托咪定組與常規(guī)治療組相比，死亡率差異無統(tǒng)計學意義。右美托咪定干預后相關基因TNF-α，IL17A，IL1B，CCL1，CCL24，CX3CL1，XCL1，IL10，IL12B，IL13的Fold絕對值趨向于1，而常規(guī)治療組治療前后，絕大多數(shù)基因Fold值變化并不大。結論 右美托咪定早期應用可調(diào)節(jié)機體細胞因子相關基因及抗炎相關基因的表達，使機體整體炎癥及抗炎反應趨于平和，從而糾正機體過度炎癥反應及免疫抑制狀態(tài)從而起到對膿毒癥的保護作用，但并不減少膿毒癥患者死亡率。

膿毒癥；右美托咪定；PCR Assay

Abstract:Objective To analyze the changes of inflammation-related gene expression in patients with sepsis were under Dexmedetomidine treatment based PCR Assay chip technology and to found its possible mechanism.Methods 50 elderly patients with severe sepsis in our hospital from January 2015 to December 2015 were randomly divided into Dexmedetomidine given treatment group and the control group(conventional treatment group).Before Dexmedetomidine given and 1,3 days post-intervention,venous blood of all patients was collected immediately and extract RNA,and then to do PCR Assay cDNA microarray.Results There was no significant difference in mortality rate between Dexmedetomidine treatment group and the conventional treatment group.After Dexmedetomidine given,absolute value of associated genes,such as TNF-α,IL17A,IL1B,CCL1,CCL24,CX3CL1,XCL1,IL10,IL12B,IL13 tends to 1.And in the conventional treatment group,the vast majority gene Fold value changes were meaningless.Conclusion Dexmedetomidine were given early in sepsis.It can regulate gene expression related to body and anti-inflammatory cytokines related genes,so that the body as a whole tends to calm inflammation and anti-inflammatory response.It can correct the body's excessive inflammatory response and immunosuppression,which played on protective effects for sepsis,but it can’t reduce mortality.

Key words:Sepsis;Dexmedetomidine;PCRAssay

膿毒癥主要是由感染及廣泛組織損傷引起的全身性炎癥反應同時常伴有免疫功能的異常，可危及生命，其臨床表現(xiàn)不一，如不同程度的低血壓、凝血病及多器官功能損害。最新數(shù)據(jù)研究顯示，嚴重膿毒癥的死亡率較前稍有下降，從以往的27.8%降至17.9%，然而其整體發(fā)病率較前明顯升高以每年8.7%逐步上升，死亡總?cè)藬?shù)較前明顯增加[1]。大多數(shù)的膿毒癥患者可以通過自身的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以控制炎性反應于適度范圍，但若炎癥反應過于強烈或不足，則可造成機體的器官功能損傷（即嚴重膿毒癥），進而多臟器功能衰竭而死亡。臨床上，嚴重的膿毒癥患者同時伴有強烈的交感神經(jīng)興奮及接受一些可能加重交感應激從而增加器官代謝氧耗的有創(chuàng)診療措施時，才應考慮給予鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜治療。作為機體對于膿毒癥等損傷的反應，全身炎性反應綜合是器官功能的主要病理生理基礎，故正確合理地應用鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜治療以調(diào)節(jié)機體的炎癥反應于“適度”，是器官功能保護和防治多器官功能障礙綜合癥重要方法之一[2]。右美托咪定（DEX）作為一種高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑，在臨床鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮方面運用廣泛，近來研究顯示，其可抑制嚴重膿毒癥大鼠炎癥反應，降低死亡率[3]。目前國內(nèi)外研究顯示：右美托咪定用于ICU膿毒癥患者鎮(zhèn)靜時，炎癥反應相關指標與未使用組相比明顯下降[4]。但對于在基因水平上來研究右美托咪定對膿毒癥患者保護作用的基因機制國內(nèi)外仍少見。炎癥反應相關基因?qū)δ摱景Y患者炎癥因子的表達起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究擬在基因水平重點針對右美托咪定抗膿毒癥患者炎癥反應相關基因的作用機制作一探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2015年1月～2015年12月收治的50個老年嚴重膿毒癥病例，隨機分為右美托咪定治療組與生理鹽水對照組（常規(guī)治療組）。嚴重膿毒癥病例的準入標準參照中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）[5]。排除標準為合并外傷、免疫缺陷性疾患、乙肝表面抗原陽性、嚴重心血管疾病、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤、長期使用鎮(zhèn)靜催眠藥物及近3個月內(nèi)使用激素或免疫抑制劑史。本研究符合醫(yī)學倫理學標準，經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，并獲得患者家屬的知情同意。另外隨機選取10例健康體檢老年人作為健康對照組（C組）。

1.2 治療方法 所有患者均在入ICU并給予常規(guī)重癥監(jiān)護、抗生素治療、復蘇、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等一般治療。右美托咪定組（A組）則先予右美托咪定負荷量2.5 μg/（kg·h）的速度iv泵入，后改用0.2～0.7 μg/（kg·h）的速度持續(xù)iv泵入鎮(zhèn)靜，常規(guī)治療組（B組）患者除了未予右美托咪定外其他治療均相同，同時予同右美托咪定組同等量的生理鹽水進行對照。用藥前與用藥后1、3天所有患者靜脈采血5 mL，取其中3 mL血液立即提取RNA，-80℃保存，待做基因芯片檢測。

1.3 觀察指標及方法 炎癥反應相關基因表達量檢測。按組及取材時間為單位，隨機取10標本的RNA，進行混勻后，進一步提取mRNA，取2μg mRNA使用superscriptⅡ和Random Primer Hexamers（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成并純化cDNA。然后在Human Cytokines&Chemokines PCR Array的96孔板中各加入20 ng cDNA，依RT2Profiler? PCR Array使用說明設置循環(huán)數(shù)并進行PCR并計算出每個孔板中的Ct數(shù)。采用ΔΔCt方法計算每個處理組中的每個通路相關基因的ΔCt。ΔCt（組1）=Ct平均值-組1陳列管家基因平均CT值，ΔCt（組2）=Ct平均值-組2陳列管家基因平均CT值。計算2個PCR Array（或兩組）中每個基因的ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt（右美托咪定干預組）-ΔCt（常規(guī)治療組）。同過2-ΔΔCt計算組2與組1對應基因的表達差異。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0（SPSS，Inc，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計數(shù)資料組間率（%）的比較采用c2檢驗。組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料 本實驗研究最終共納入50例老年嚴重膿毒癥患者，右美托咪定組25例，其中男13例，女12例；年齡 61～93歲，平均（73.96±8.41）歲；APACHEⅡ評分（19.84±6.12）分。對照組25例，其中男11例，女14例；年齡60～87歲，平均（74.08±8.00）歲；APACHEⅡ評分（18.80±6.01）分。兩組患者治療前一般臨床資料相關指標組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 臨床治療及轉(zhuǎn)歸 右美托咪定組患者平均住院時間與常規(guī)治療組接近；兩組患者28 d死亡率差異無統(tǒng)計學意義?；颊咦罱K死亡原因多數(shù)為 MODS。見表1。

表1 不同治療方法兩組老年嚴重膿毒癥患者治療前后預后指標比較Table 1 Comparison of prognosis in two groups of patients with severe sepsis before and after treatment

2.3 相對于健康對照組（C組），右美托咪定干預組（A組）及常規(guī)治療組（B組）Fold值改變情況 右美托咪定干預后IL17A，IL1B，CCL1，CCL24，CX3CL1，XCL1的Fold絕對值趨向于1，而常規(guī)治療組治療前后，絕大多數(shù)Fold值變化并不大。見表2。

3 討論

隨著各國進入老齡化社會，膿毒癥的發(fā)病率也隨之升高。雖然隨醫(yī)學的進步，其死亡率有所下降，但總體死亡人數(shù)卻逐年上升。因此，膿毒癥的治療仍是當前防治的重中之重[1]。膿毒癥早期常以全身性促炎反應為主要特征，它可發(fā)展為嚴重膿毒癥及膿毒性休克。

右美托咪定是一種強效的α2腎上腺素受體激動，具有鎮(zhèn)靜，止痛和抗焦慮作用，對循環(huán)影響相對較小，對呼吸無明顯的臨床癥狀呼吸抑制[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生膿毒癥時使用右美托咪定對炎癥相關基因表達有一定的調(diào)節(jié)作用，但并不改善28 d死亡率，并不減少平均住院時間。具體如下。

（1）右美托咪定可通過調(diào)節(jié)TNF-a及IL-1b基因的表達，進而使得膿毒癥早期過度炎癥反應趨于平和。

據(jù)膿毒癥相關理論即“第一次打擊假說”描述了促炎細胞因子在膿毒性休克發(fā)生發(fā)展中起的作用。大量的數(shù)據(jù)表明促炎細胞因子在膿毒性休克中扮演著有害影響。如：重組的TNF-α及IL-1b干預后的動物模型模擬膿毒性休克的特征，相反予抗TNF-α抗體或IL-1Ra可保護膿毒癥大鼠免受致命的內(nèi)毒素和革蘭氏陰性桿菌致膿毒癥的損傷[7-8]。另有研究顯示：在大多數(shù)的膿毒癥患者中TNF-a及 IL-1b的濃度升高明顯，且其升高程度與膿毒癥的危重程度呈相關性[9]。此外，TNF-α啟動子區(qū)的多態(tài)性致使TNF-α產(chǎn)量增加，一旦感染性休克的出現(xiàn)可顯著增加死亡率[9]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒 癥患者TNF-α及IL-1b的Fold值明顯升高，經(jīng)右美托咪定處理后，TNF-α、IL-1b基因的過度表達趨于正常。說明右美托咪定對引起膿毒癥的過度炎癥反應的驅(qū)動基因過度表達有明顯抑制作用，從而起到保護膿毒癥的作用。

表2 相對于健康對照組，右美托咪定干預前后及常規(guī)治療組治療前后相關有意義基因的表達情況Table 2 Compare to the healthy control group，the significant differences in gene expression before and after dexmedetomidine intervention treatment and conventional treatment group

（2）右美托咪定可通過調(diào)節(jié)IL-17A基因的表達，進而使得膿毒癥早期過度炎癥反應趨于正常。

近年來研究發(fā)現(xiàn)IL-17A（以前稱為IL-17）包括它的同源細胞因子IL-17F都是是一種促炎細胞因子[10]。它們可誘導許多細胞因子和趨化因子的表達如：IL-1，IL-6，TNFα，CXCL1及CXCL2[11]。相關研究發(fā)現(xiàn)IL-17A似乎沒有直接調(diào)節(jié)T細胞的功能，而是作用于其它細胞類型（例如，巨噬細胞，成纖維細胞和上皮細胞和內(nèi)皮細胞）誘導的促炎因子的釋放，特別是促進嗜中性粒細胞的釋放。IL-17A可能發(fā)展為可以協(xié)助抵抗胞外及黏膜上皮屏障的細菌[12]，IL-17A是由TH 17細胞中產(chǎn)生的關鍵細胞因子，它主要在介導的自身免疫和炎性疾病中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥組患者較常規(guī)治療組IL-17A明顯升高（P＜0.05），經(jīng)右美托咪定處理后，IL-17A基因Fold值較前明顯下降，說明右美托咪定可通過抑制促炎相關基因IL-17A的表達，從而起到促進膿毒癥的過度炎癥反應趨向正常表達，從而起到對膿毒癥機體的保護作用。

此外，膿毒癥患者在右美托咪定干預后，細胞因子相關基因CCL1，CCL24，CX3CL1，XCL1的Fold值的絕對值趨向于1，即經(jīng)右美托咪定干預后，細胞因子相關基因表達趨向于正常。同時，經(jīng)其干預后，抗炎相關基因IL10，IL12B，IL13表達也趨于正常。說明右美托咪定能通過調(diào)節(jié)細胞因子及抗炎相關基因的表達，從而起到保護作用。

綜上所述，膿毒癥患者常同時合并過度炎癥反應及免疫抑制狀態(tài)，右美托咪定早期應用可調(diào)節(jié)機體細胞因子相關基因及抗炎相關基因的表達，使機體整體炎癥及抗炎反應趨于平和，從而糾正機體過度炎癥反應及免疫抑制狀態(tài)從而起到對膿毒癥的保護作用，但并不減少28天死亡率。本研究由于例數(shù)有限，仍需進一步研究證實。

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Effect of dexmedetomidine on expression of inflammation related genes in patients with sepsis

Ren De-cai1,Lin Ming-rui2,Xiao Xiong-jian3,Lin Jian-dong3
(1.Intensive Care Unit,Pingtan Comprehensive ExperimentalArea Hospital,Fuzhou,Fujian,364000,China;2.Intensive Care Unit,theAffiliated People’s Hospital of Fujian Traditional Medical University,Fuzhou,Fujian,350004,China;3.Intensive Care Unit,the FirstAffiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,Fujian,350004,China)

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.29.001

中華醫(yī)學會臨床醫(yī)學科研專項資金國瑞重癥科研項目（13091440529）

林建東，E-mail：linjd@tom.com