樹枝狀聚合物納米藥物的制備及性能表征

單玉萍， 陳 陽， 周思源， 汪世陽

(長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130012)

樹枝狀聚合物納米藥物的制備及性能表征

單玉萍， 陳 陽*， 周思源， 汪世陽

(長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130012)

以甲氨蝶呤作為藥物負(fù)載，采用紫外可見分光光度計研究了不同代數(shù)(G2.0、G4.0、G4.5、G8.0)polyamidoamine樹枝狀大分子(PAMAM)對甲氨蝶呤的包覆效果，結(jié)果表明,相同末端-NH2基團(tuán)不同代數(shù)的PAMAM樹枝狀大分子載藥量依次為G8.0>G4.0>G2.0，而具有-COOH基團(tuán)的G4.5PAMAM樹枝狀大分子的包覆效果相對最差。

PAMAM樹枝狀大分子； 甲氨蝶呤； 納米藥物； 藥物負(fù)載

0 引 言

MTX是一種二氫葉酸還原酶抑制劑，其與二氫葉酸還原酶有高度親和力，比二氫葉酸結(jié)合二氫葉酸還原酶的能力高出10倍，使二氫葉酸不能轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，造成DNA合成障礙，干擾RNA，從而抑制細(xì)胞的生長，是廣譜抗腫瘤藥物。與此同時,對體內(nèi)尤其是增殖迅速的組織,如粘膜、骨髓等同樣也可以造成損害，導(dǎo)致一系列的臨床癥狀，表現(xiàn)出對人體較大的毒性作用[1-2]。人們一直努力開發(fā)能夠減少副作用的新型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體系，以降低MTX的毒副作用。聚酰胺-胺型樹枝狀大分子(PAMAM)具有穩(wěn)定、無免疫原性，對生物活性劑轉(zhuǎn)運(yùn)效率等特點(diǎn)[3-4]，是近年來國外開發(fā)的一類新型功能高分子，引起相關(guān)領(lǐng)域普遍關(guān)注[5]。PAMAM分子在結(jié)構(gòu)上具有高度的集合對稱性、精確的分子結(jié)構(gòu)、大量的官能團(tuán)、分子內(nèi)存在空腔及分子鏈增長具有可控性等許多獨(dú)特的性質(zhì)，使其有可能成為MTX最理性的包覆藥物。

PAMAM分子通過Michael加成和酰胺化反應(yīng)的重復(fù)次數(shù)控制，每重復(fù)一次得到的樹枝狀大分子稱為一代[6-7]。聚酰胺-胺樹枝狀大分子由初始引發(fā)核、與初始引發(fā)核徑向連接的重復(fù)支化單元和與最外層重復(fù)支化單元連接的末端基組成，通過這種方法合成的樹枝狀大分子具有確定分子量、結(jié)構(gòu)精確、分子形狀及尺寸可控，呈分散性[8]，還具有穩(wěn)定、在使用劑量下無毒性、適時降解且降解產(chǎn)物無毒性等特點(diǎn)[9]。

聚酰胺-胺樹枝狀大分子表面官能團(tuán)的數(shù)目隨代數(shù)的增加而呈指數(shù)增長，最終導(dǎo)致表面空間擁擠而產(chǎn)生幾何變化[10]，當(dāng)代數(shù)較低時一般為開放性的分子構(gòu)型，隨著代數(shù)的增加和支化的繼續(xù)，從第四代樹枝狀大分子開始就形成了較為封閉的、多孔的球狀結(jié)構(gòu)，第八代則是表面幾乎無空隙的球狀結(jié)構(gòu)[11]。

PAMAM獨(dú)特的多孔球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部空腔不僅可物理包裹小分子藥物，通過靜電引力和氫鍵相互作用將藥物分子捕獲在樹枝狀大分子內(nèi)或樹枝狀大分子間[12]，而且其端基官能團(tuán)比同類聚合物具有更高的化學(xué)反應(yīng)性，可以連接各種藥物、抗體等。該載藥系統(tǒng)可通過簡單攪拌包埋藥物，避免化學(xué)合成對藥物的破壞和釋放。當(dāng)進(jìn)入人體后，PAMAM載藥一方面通過擴(kuò)散從大分子內(nèi)部釋放出來，另一方面，在樹枝狀大分子表面以共價結(jié)合藥物分子可通過化學(xué)鍵的水解或者酶解進(jìn)行釋放。

樹枝狀大分子作為藥物載體可延長藥物在血液中的滯留時間，控制藥物在體內(nèi)的釋放效率，保護(hù)藥物以免受到環(huán)境的破壞，且可以通過改變酸堿度釋放藥物，實(shí)現(xiàn)靶向和控制釋放，具有很好的緩控釋作用和靶向性[13-14]。

目前，國外期刊多見于PAMAM分子作為藥物載體的緩控釋及靶向性等研究。此外，PAMAM分子體進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程也有報導(dǎo)。葉玲[15]等研究了G5.0 PAMAM分子與藥物MTX的包合與釋放，結(jié)果表明，G5.0 PAMAM分子對藥物有很好的緩控釋作用。Yang B[16]等利用AFM力示蹤技術(shù)追蹤PAMAM單分子進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程。首次明確了PAMAM單分子進(jìn)入細(xì)胞所需的力和速率。但是對比不同代數(shù)PAMAM分子的載藥能力國內(nèi)外罕有報導(dǎo)。

由于不同代數(shù)PAMAM結(jié)構(gòu)的不同，將顯著影響對藥物的載藥量。文中將采用不同代數(shù)的PAMAM樹枝狀大分子作為載體，通過物理包覆方法，研究PAMAM包覆MTX負(fù)載率的影響，為樹枝狀聚合物納米藥物的制備提供實(shí)驗參考。

1 實(shí)驗部分

1.1試劑與儀器

PAMAM樹枝狀大分子G2.0、G4.0、G8.0、G4.5，均來自威海晨源高分子；

甲氨蝶呤MTX(Aladdin);

超濾管(3K);

移液槍(Eppendorf);

離心機(jī)(Eppendorf);

磁力攪拌器;

分析天平;

Cary 50型紫外可見分光光度計,上?？茖W(xué)儀器有限公司;

G2.0:Mw=3 256 g/mol，末端氨基數(shù)16，溶劑為甲醇溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%；

G4.0:Mw=14 215 g/mol，末端氨基數(shù)64，溶劑為甲醇溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%；

G8.0:Mw=233 383 g/mol，末端氨基數(shù)1 024，溶劑為甲醇溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%；

G4.5:Mw=23 438 g/mol，末端羧基數(shù)128，固體粉末。

1.2物理包覆

稱取MTX 1 mg投入反應(yīng)瓶中，加入1 mL去離子水，形成飽和溶液。按照摩爾比(MTX)/(PAMAM樹枝狀大分子)=1/50進(jìn)行包覆。通過公式 [m/M(MTX)/50]*Mw(PAMAM樹枝狀大分子)/40%，計算得到需要的不同代數(shù)PAMAM樹枝狀大分子甲醇溶液的質(zhì)量。反應(yīng)體系用氮?dú)獗Ｗo(hù)，密封，避光，控制溫度35 ℃，磁力攪拌器攪拌，轉(zhuǎn)速500 r/min，攪拌反應(yīng)12 h。

由于G4.5PAMAM樹枝狀大分子為固體，故計算公式為[m/M(MTX)/50]*M(G4.5PAMAM樹枝狀大分子)。其余實(shí)驗步驟均同上。

1.3實(shí)驗處理

反應(yīng)12 h后，取下反應(yīng)瓶，將PAMAM樹枝狀大分子與MTX包覆物轉(zhuǎn)移至3 K的超濾管離心10 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min。由于PAMAM樹枝狀大分子與MTX的包覆物分子尺寸較大，留在超濾管上層，所以加入1 mL無水乙醇于超濾管中，離心清洗上層產(chǎn)品除去殘留雜質(zhì)后，再用去離子水離心清洗，得到干凈的產(chǎn)物。G2.0、G4.0、G4.5、G8.0 PAMAM樹枝狀大分子與MTX包覆物的處理方法均與上述相同。得到的不同代數(shù)的PAMAM樹枝狀大分子與MTX包覆物產(chǎn)品均用UV-Vis進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與討論

不同代數(shù)PAMAM樹狀大分子示意圖如圖1所示。

圖1 G2.0、G4.0、G4.5、G8.0 PAMAM結(jié)構(gòu)示意圖

所有代數(shù)PAMAM樹狀大分子都是對稱枝狀的球形結(jié)構(gòu)。整數(shù)代PAMAM樹狀大分子有著共同的重復(fù)單元。

圖1(a)為G2.0 PAMAM樹狀大分子的結(jié)構(gòu)式及示意圖，G2.0PAMAM樹狀大分子的末端有16個-NH2基團(tuán);

圖1(b)為G4.0PAMAM樹狀大分子示意圖，末端為64個-NH2基團(tuán);

圖1(c)為G4.5PAMAM樹狀大分子示意圖，末端為128個-COOH基團(tuán);

圖1(d)為G8.0PAMAM樹狀大分子結(jié)構(gòu)示意圖，末端為1 024個-NH2基團(tuán)。隨著PAMAM樹狀大分子代數(shù)增加，分子尺寸也隨之增大，分子球體表面化學(xué)基團(tuán)數(shù)量呈指數(shù)增加。

通過實(shí)驗，將MTX藥物分子包覆進(jìn)入不同代數(shù)的PAMAM樹枝狀大分子中。樹枝狀大分子負(fù)載藥物甲氨蝶呤的示意圖如圖2所示。

樹枝狀結(jié)構(gòu)表示PAMAM樹枝狀化合物，球形結(jié)構(gòu)表示MTX藥物分子。藥物分子經(jīng)過包覆后可以進(jìn)入PAMAM樹枝狀大分子內(nèi)部間隙。實(shí)驗得到的產(chǎn)物用于后續(xù)表征測試分析。

不同代數(shù) PAMAM樹枝狀大分子和MTX的UV-Vis圖譜如圖3所示。

(a) G2.0 PAMAM的UV-Vis圖譜

(b) G4.0 PAMAM的UV-Vis圖譜

(c) G4.5 PAMAM的UV-Vis圖譜

(d) G8.0 PAMAM的UV-Vis圖譜

(e) MTX的UV-Vis圖譜圖3 不同代數(shù)PAMAM樹枝狀大 分子和MTX的UV-Vis圖譜

由圖3可見，不同代數(shù)PAMAM樹枝狀大分子的紫外吸收峰形相似，在λ=279 nm附近均有紫外吸收特征峰，λ=210 nm附近具有較高的紫外吸收峰。其紫外吸收曲線的相似性可能是因為PAMAM樹枝狀大分子都具有相同的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元和對稱的枝化結(jié)構(gòu)(見圖1)。而MTX在λ=370、302、265、205 nm處有紫外吸收峰，其中λ=370 nm處紫外吸收峰的峰值較低，而波長在302、265、205 nm處對應(yīng)的紫外吸收峰高度相近。

通過實(shí)驗得到不同代數(shù)PAMAM樹枝狀大分子負(fù)載藥物MTX后形成的包覆產(chǎn)物的UV-Vis圖譜如圖4所示。

圖中(a)、(b)、(c)、(d)分別是G2.0、G4.0、G4.5、G8.0 PAMAM樹枝狀大分子與MTX形成納米藥物的UV-Vis圖譜。

(a) G2.0 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

(b) G4.0 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

(c) G4.5 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

(d) G8.0 PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜圖4 不同代數(shù)PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜

圖中,B1、B2、B3、B4是不同代數(shù)PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis圖譜。對照A1、A2、A3、A4不同代數(shù)PAMAM樹枝狀大分子紫外吸收曲線可以看出，包覆產(chǎn)物的紫外吸收曲線發(fā)生很大變化。其中波長在370、302、260 nm處的峰為產(chǎn)物的UV-Vis特征峰，所有產(chǎn)物的UV-Vis圖譜中，紫外吸收峰對應(yīng)的波長位置相同。其中，λ=370 nm處是MTX的UV-Vis特征峰。PAMAM樹枝狀大分子包覆MTX后，MTX在λ=302 nm或260 nm處較強(qiáng)的UV-Vis特征峰掩蓋了PAMAM樹枝狀大分子在λ=275 nm附近較弱的UV-Vis特征峰，但在波長200～260 nm區(qū)間內(nèi)PAMAM的UV-Vis特征峰未受影響，由此可知,MTX包覆進(jìn)入了PAMAM內(nèi)部空腔。

整數(shù)代的PAMAM樹枝狀大分子的末端都是相同的氨基，不同整數(shù)代PAMAM的末端樹枝狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量隨著代數(shù)的增加而呈指數(shù)增加，空間尺寸和內(nèi)部空腔數(shù)量也隨之增大(見圖1)。由于載體大小不同，不同整數(shù)代PAMAM樹枝狀大分子包裹MTX藥物分子的量也不同。不同整數(shù)代的末端為氨基的PAMAM包覆MTX產(chǎn)物的UV-Vis圖譜如圖5所示。

圖5 不同整數(shù)代的末端為氨基的PAMAM 包覆MTX產(chǎn)物的UV-Vis圖譜

圖中：A、B、C三條曲線分別對應(yīng)不同代數(shù)的PAMAM-MTX產(chǎn)物。不同代數(shù)的PAMAM-MTX納米藥物的UV-Vis峰對應(yīng)波長位置基本相同。由于不同代數(shù)PAMAM包覆MTX的量不同，所以在λ=250 nm到λ=370 nm之間，PAMAM-MTX納米藥物中MTX的UV-Vis特征峰對應(yīng)縱坐標(biāo)的吸光度值大小也不同。在包覆反應(yīng)實(shí)驗中，投入不同代數(shù)PAMAM樹枝狀大分子的物質(zhì)的量相同，MTX投藥量均為1 mg，由此可知，PAMAM-MTX中MTX的量體現(xiàn)了不同整數(shù)代PAMAM包覆藥物的性能。由郎伯比爾定律A=lg(1/T)=Kbc可知，K為摩爾吸收系數(shù)，b為吸收層厚度，c為吸光物質(zhì)的濃度，對于MTX在K、b、c為定值情況下，由于吸光度A值可確定不同整代數(shù)的PAMAM包覆MTX的實(shí)際效果。圖5中所示G2.0、G4.0、G8.0 PAMAM-MTX包覆量呈上升趨勢。G2.0包覆量最低，G8.0包覆量最高。這清晰表明,PAMAM樹枝狀大分子隨著代數(shù)增加，空間結(jié)構(gòu)增大，內(nèi)部空腔增多，其包覆藥物的能力也顯著提高。

G4.5PAMAM-MTX和G4.0PAMAM-MTX的UV-Vis對比圖如圖6所示。

圖6 G4.5PAMAM-MTX和G4.0PAMAM-MTX 的UV-Vis對比圖

圖6中,G4.0PAMAM-MTX和G4.5PAMAM-MTX納米藥物中MTX的量相差很大，G4.0 PAMAM包覆MTX的量明顯高于G4.5 PAMAM。G4.0和G4.5代PAMAM樹枝狀大分子相差半代，二者都是樹枝狀展開的球形空間結(jié)構(gòu)。G4.5 PAMAM分子尺寸較G4.0 PAMAM略大，但二者末端基團(tuán)不同，G4.0末端是-NH2，G4.5末端是-COOH。分子尺寸稍大的G4.5 PAMAM包覆藥物的性能比分子尺寸略小的G4.0 PAMAM差，這與二者末端不同官能團(tuán)的性質(zhì)有直接關(guān)系。G4.5 PAMAM末端的大量羧基在溶液中電離形成帶負(fù)電的球體，與同是帶羧基的MTX相互排斥，盡管G4.5 PAMAM分子尺寸較大，但分子球體表面大量的負(fù)電荷屏蔽了內(nèi)部樹枝結(jié)構(gòu)形成的空腔[17]，導(dǎo)致G4.5PAMAM樹枝狀大分子包覆藥物能力明顯下降。另外，PAMAM對pH有很強(qiáng)敏感性，由于G4.5PAMAM和MTX帶有大量羧基使得反應(yīng)體系呈酸性而導(dǎo)致PAMAM樹枝狀結(jié)構(gòu)僵化[18]，這也導(dǎo)致包覆藥物的能力會下降。所以，相對于PAMAM的分子大小來說，PAMAM樹枝狀大分子表面官能團(tuán)的性質(zhì)對載體包覆藥物能力影響更大。

3 結(jié) 語

采用物理包覆的方法制備的不同代收PAMAM-MTX納米藥物，整數(shù)代末端帶-NH2的PAMAM包覆藥物MTX的性能從高代數(shù)到低代數(shù)依次減弱。這是因為樹枝狀結(jié)構(gòu)呈指數(shù)減小后，內(nèi)部空腔減小導(dǎo)致的。另外，G4.5代PAMAM樹枝狀大分子和MTX末端大量羧基在溶液中電離而使溶液為酸性，由于PAMAM樹枝狀大分子對pH敏感，在酸性溶液中分子變得僵硬，這也對包覆效果有很大影響。而類似G4.5這樣的半代PAMAM樹枝狀大分子末端是-COOH形成表面帶負(fù)電的球面，帶有負(fù)電的球面會與溶液中因MTX電離產(chǎn)生的-COOH末端產(chǎn)生排斥作用，從而大大降低PAMAM樹枝狀大分子包覆藥物的性能。

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Preparationandcharacterizationofpolyamidoaminedendrimersnano-drugs

SHAN Yuping, CHEN Yang*, ZHOU Siyuan, WANG Shiyang

(School of Chemistry & Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

Taking Methotrexate (MTX) as drug encapsulation, the encapsulation effect of different algebra (G2.0、G4.0、G4.5、G8.0)polyamidoamine dendrimers (PAMAM)to MTX is investigated with UV-visible spectrophotometer. The results indicate that encapsulation rate of the PAMAM with -NH2base is as following: G8.0>G4.0>G2.0; while the encapsulation effect of G4.5PAMAM with -COOH is the worst.

PAMAM dendrimers； Methotrexate (MTX)； nano-drugs； drug encapsulation.

O 652.1

A

1674-1374(2017)04-0386-07

2017-04-16

吉林省自然科學(xué)基金資助項目(20160520133JH)

單玉萍(1982-)，女，漢族，黑龍江尚志人，長春工業(yè)大學(xué)教授，博士，主要從事細(xì)胞膜上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)動態(tài)過程研究,E-mail:shanyp@ccut.edu.cn. *通訊作者：陳 陽(1994-)，男，漢族，吉林德惠人，主要從事樹枝狀聚合物包覆納米藥物的制備及性能表征方向研究,E-mail:chenyang5186@126.com.

10.15923/j.cnki.cn22-1382/t.2017.4.12