基于紅熒烯納米材料構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于靈敏檢測(cè)β淀粉樣蛋白的研究

劉佳莉，湯雨衡，卓 穎，柴雅琴，袁 若

（重慶市現(xiàn)代分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

基于紅熒烯納米材料構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于靈敏檢測(cè)β淀粉樣蛋白的研究

劉佳莉，湯雨衡，卓 穎*，柴雅琴，袁 若*

（重慶市現(xiàn)代分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

該實(shí)驗(yàn)合成了一種以紅熒烯為發(fā)光體的納米棒（SDS-Rub），并基于此構(gòu)建了高靈敏的信號(hào)減小型電致化學(xué)發(fā)光（ECL）免疫傳感器用于β淀粉樣蛋白的檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)以二氧化硅（SiO2）為模版制備了二茂鐵納米微球（PAA/PEI-Fc），極大限度地提高了二茂鐵的固載量，更加靈敏地猝滅ECL信號(hào)。首先，將紅熒烯納米材料修飾到玻碳電極表面，將制得的銀納米線滴涂到修飾了的電極上，用于固載一抗。利用牛血清白蛋白（BSA）封閉多余的活性位點(diǎn)后，將抗原(Ag)孵育到電極上。此時(shí)，該傳感器檢測(cè)到高的ECL信號(hào)。利用抗原抗體特異性結(jié)合，將二茂鐵二抗復(fù)合物（Fc-Ab2）孵育到電極上，由于二茂鐵的猝滅作用，ECL信號(hào)降低?；贓CL信號(hào)的變化值與β淀粉樣蛋白濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在β淀粉樣蛋白抗體濃度范圍10 fg/mL～100 ng/mL，該傳感器的檢測(cè)限為3.2 fg/mL。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）；免疫傳感器；紅熒烯；β淀粉樣蛋白（Aβ）

Abstract:In this study,the rubrene nanomaterials were synthesized as a luminophor to construct the sensitive electrochemiluminescence(ECL)immunosensor for the detection of β-amyloid protein.The ferrocene nanoparticles(PAA/PEI-Fc)were prepared by using silica as template,which greatly improved the load capacity of the(PAA/PEIFc)to quench the ECL signal more sensitively.Firstly,the RubNRs was decorated on the polished GCE,then,the silver nanowires were dropped on the electrode to immobilize the capture antibody(Ab1).After immobilizing with the BSA to block the active site,the Aβ antigen(Ag)was incubated.Finally,the secondary antibody bioconjugate(Fc-Ab2)was connected to the surface of the electrode because of the specific binding of antibody to antigen,which obtained a declining ECL signal.The results showed that there was a good linear relationship of the concentration of β-amyloid protein at the concentration range of 10 fg/mL～100 ng/mL,with the detection limit of 3.2 fg/mL.This work can also provide a new approach for ultrasensitive detection of Aβ.

Key words：electrochemiluminescence(ECL);immunosensor;rubrene;amyloid-β protein（Aβ）

0 引言

β淀粉樣蛋白 （Aβ），由39-43個(gè)氨基酸組成，是大腦皮質(zhì)老年斑的主要成分，可以有效消弱突觸結(jié)構(gòu)和功能。這種二聚體是最小的突觸毒性物質(zhì)，是引起阿爾茨海默病的主要物質(zhì)[1]。近年來(lái)，生物傳感器發(fā)展迅速，已逐漸應(yīng)用于工業(yè)、食品、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。免疫傳感器作為一種新興的生物傳感器，因其鑒定物質(zhì)的靈敏度、穩(wěn)定性及高度特異性受到青睞。免疫傳感器的問(wèn)世使得傳統(tǒng)的免疫分析方法發(fā)生了很大的改變，它將傳統(tǒng)的免疫測(cè)試和生物傳感技術(shù)融為一體，集兩者的諸多優(yōu)點(diǎn)于一身，不僅提高了靈敏度和檢測(cè)精度、減少了分析時(shí)間，也使得測(cè)定過(guò)程變得簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，有著廣闊的應(yīng)用前景。免疫傳感器的原理為：基于抗原-抗體特異性反應(yīng)進(jìn)行分子識(shí)別，然后通過(guò)物理或化學(xué)變化實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)化，最后通過(guò)監(jiān)測(cè)可測(cè)信號(hào)的變化進(jìn)行定量分析?？乖涂贵w結(jié)合即發(fā)生免疫反應(yīng)，其特異性極高，具有極高的選擇性和靈敏度。免疫傳感器可以分為直接型和間接型。直接法是將抗體固定在電極上后,通過(guò)抗原抗體間的特異性結(jié)合孵育被測(cè)抗原，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的轉(zhuǎn)換對(duì)抗原進(jìn)行測(cè)定。間接型免疫傳感器的原理是將捕獲抗體（capture antibody,Ab1）固定在電極上后通過(guò)特異性結(jié)合將抗原 （antigen,Ag）孵育在電極之上，最后再將標(biāo)記抗體（secondary antibody,Ab2）孵育在電極之上，形成夾心免疫模式進(jìn)行檢測(cè)。間接法相對(duì)于直接法有更好的靈敏度，且干擾也相對(duì)小于直接法，對(duì)于該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的β淀粉樣蛋白來(lái)說(shuō)更具有優(yōu)勢(shì)[2]。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）技術(shù)是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，它具有選擇性高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、靈敏度高、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、操作方便、抗干擾能力強(qiáng)、分析速度快和線性響應(yīng)范圍寬等特點(diǎn)[3]。ECL的基本原理是通過(guò)發(fā)光體與共反應(yīng)試劑在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生ECL信號(hào)。首先，對(duì)電極施加一定的電壓，電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在電極表面發(fā)生電子傳遞反應(yīng)而產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)輻射出光子發(fā)光，最后用光電倍增管捕獲和測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)痕量分析[4]。常見(jiàn)的電致化學(xué)發(fā)光體系有：聚芳香族碳?xì)浠衔铮≒AH）；酰肼類化合物，其代表物是魯米諾；無(wú)機(jī)金屬配合物或螯合物，其代表物是聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+。目前，電致化學(xué)發(fā)光的分析主要應(yīng)用于藥物及生化分析，免疫分析，有機(jī)分析，無(wú)機(jī)分析，核酸雜交分析等領(lǐng)域[5]。

紅熒烯 (Rubrene)，5,6,11,12-四苯基四苯，紅色至淺棕色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，屬于多環(huán)芳烴簇(PHA)化合物，是一種重要的小分子有機(jī)半導(dǎo)體材料[6]。紅熒烯是用于實(shí)現(xiàn)紅色有機(jī)發(fā)光二級(jí)管和白色有機(jī)發(fā)光二級(jí)管的材料。它作為一種高效的熒光材料，能通過(guò)從未占據(jù)態(tài)到占據(jù)態(tài)電子的躍遷而發(fā)出可見(jiàn)黃光，將它摻雜到空穴轉(zhuǎn)移層中，能夠提高有機(jī)發(fā)光二極管的效率和穩(wěn)定性；紅熒烯與其他所有的多環(huán)芳烴簇化合物一樣有著非定域π-電子，使得分子的穩(wěn)定性加強(qiáng)并使分子具有相對(duì)較小的能帶寬度，紅熒烯分子的這些特性決定了它的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)[7]并為有機(jī)電子和光電子裝置的研究和應(yīng)用提供了較理想的條件。研究表明，紅熒烯晶體存在三種晶系：三斜晶系、正交晶系和單斜晶系，這三種晶系可通過(guò)不同的生長(zhǎng)條件得到。其中紅熒烯正交晶系中能使四并苯環(huán)更為平面化并使分子更容易堆積在一起，沿著紅熒烯分子堆積方向存在的π-π堆積，是紅熒烯晶體有著很高的電子遷移率的根本原因[8-9]。

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，這大約相當(dāng)于10~100個(gè)原子緊密排列在一起的尺度。納米材料的應(yīng)用范圍極其廣泛，如天然納米材料、納米磁性材料、納米陶瓷材料、納米傳感器、納米傾斜功能材料、納米半導(dǎo)體材料、納米催化材料、碳納米管等。納米材料大致可分為納米粉末、納米纖維、納米膜、納米塊體等四類。其中納米粉末開(kāi)發(fā)時(shí)間最長(zhǎng)、技術(shù)最為成熟，是生產(chǎn)其他三類產(chǎn)品的基礎(chǔ)[10]。納米技術(shù)作為一種最具有市場(chǎng)應(yīng)用潛力的新興科學(xué)技術(shù)，其潛在的重要性毋庸置疑，一些發(fā)達(dá)國(guó)家已投入大量的資金進(jìn)行研究工作。在國(guó)內(nèi)，許多科研院所、高等院校也組織科研力量，開(kāi)展納米技術(shù)的研究工作，并取得了一定的研究成果。近年來(lái)，將納米材料應(yīng)用到傳感器中已成為一大研究熱點(diǎn)。

該實(shí)驗(yàn)以紅熒烯納米材料（SDS-Rub）為發(fā)光體，二茂鐵納米微球?yàn)殁鐒?，采用免疫夾心模式構(gòu)建了高靈敏的信號(hào)減小型ECL免疫傳感器。首先將紅熒烯納米材料（SDS-Rub）修飾到玻碳電極作為發(fā)光體，然后將銀納米線固載在電極上用于固載捕獲抗體（Ab1），通過(guò)Ag-N鍵將Ab1孵育到電極表面。用牛血清蛋白（BSA）封閉其非特異性位點(diǎn)后孵育不同濃度的抗原（Ag）。此時(shí)，該傳感器檢測(cè)到高的ECL信號(hào)。最后通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合，將二茂鐵二抗復(fù)合物(Fc-Ab2)結(jié)合到電極上制備生物傳感器。由于二茂鐵的猝滅作用，ECL信號(hào)降低。該實(shí)驗(yàn)基于夾心免疫模式，通過(guò)測(cè)定ECL信號(hào)的變化值與β淀粉樣蛋白濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Aβ的超靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型ECL分析儀 （西安瑞邁電子科學(xué)技術(shù)有限公司）；CHI660C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；三電極體系：玻碳電極（GCE，Φ＝4 mm）及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極；Ag/AgCl參比電極；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) （長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；移液槍（成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司）；SCZL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器；AB204-S電子天平(瑞士Metter Toledo公司)；溶解洗滌等使用BRANSONIC200超聲清洗儀 （德國(guó) BRANSON ULTRASCHALL 公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

十二烷基硫酸鈉（SDS）；紅熒烯（Rub）；四氫呋喃（THF）；三乙胺（TEA)，氯化鐵（FeCl3）；乙二醇 （EG）；聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）；硝酸銀(AgNO3）；乙醇（Ethanol）；聚乙烯亞胺（PEI）；羧基化二茂鐵（Fc-COOH）；聚丙烯酸（PAA）；氫氟酸（HF）；1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）；β 淀粉樣蛋白（Aβ）及其抗體；牛血清白蛋白（BSA 0.25%）購(gòu)于 Sigma公司(美國(guó))；磷 酸 緩 沖 溶 液 （PBS，0.1 mol/L，pH7.4） 是由 0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純,實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

1.2 紅熒烯納米材料（SDS-Rub）的制備

首先將50 mL的燒杯及攪拌子用鉻酸洗液充分浸泡后，用蒸餾水超聲洗滌干凈后晾干，稱取0.0216 g十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解到10 mL蒸餾水中。另取一清潔干燥的10 mL燒杯，稱取5 mg紅熒烯 （Rub），充分溶于5 mL四氫呋喃（THF）后逐滴加入到10 mL十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液中，攪拌 30 min，超聲 12 min后離心洗滌，加蒸餾水稀釋避光保存。

1.3 羧基化二茂鐵-二抗復(fù)合物(Fc-Ab2)的制備

取5 mmol/L羧基化二茂鐵溶于乙醇中，加入40 mmol/L 1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）,10mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）配成的溶液在4℃下不斷攪拌2 h活化。然后加入1%聚乙烯亞胺（PEI）溶液，室溫下攪拌過(guò)夜使其與二茂鐵上的羧基形成酰胺鍵，得到PEI-Fc-COOH。

稱取1 mg SiO2納米顆粒均勻分散到10 mL乙醇中，加入100 μL已經(jīng)制備的PEI-Fc-COOH溶液不斷攪拌1 h，以SiO2納米顆粒為核，PEIFc-COOH包裹在外。反應(yīng)完成后，離心（8000 r/min，2 min）得到 SiO2@PEI-Fc-COOH，用乙醇離心洗滌兩次，洗去多余的PEI-Fc-COOH。將1%聚丙烯酸（PAA）加入到上述材料中攪拌1 h，離心洗滌除去多余的PAA后，依次加入PEI-Fc-COOH,PAA和PEI-Fc-COOH進(jìn)行層層自組裝包裹，然后離心洗滌得到核殼結(jié)構(gòu)的SiO2@PAA/PEI-Fc。將氫氟酸溶液逐滴加入到所得的核殼型納米材料中，當(dāng)溶液逐漸變?yōu)橥该鲿r(shí)停止滴加，離心洗滌后分散到去離子水中,得到二茂鐵納米微球（PAA/PEI-Fc）。最后將層層包裹的納米顆粒在40 mmol/L 1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC）10 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）配成的溶液中4℃下與二抗進(jìn)行交聯(lián)，最后離心（8000 r/min，5 min）得到二茂鐵二抗復(fù)合物(Fc-Ab2)放入4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 銀納米線(AgNWs)的制備

稱取0.0016 g氯化鐵 （FeCl3）溶解到10 mL乙二醇 （EG）中，劇烈攪拌下加入0.15 mol/L（0.162 g）聚乙烯吡咯烷酮（PVP），之后逐滴加入10 mL 的 0.1 mol/L（0.17 g）硝酸銀(AgNO3）乙二醇（EG）溶液。攪拌均勻后，將溶液轉(zhuǎn)移到50 mL的反應(yīng)釜中，在160℃的條件下真空干燥箱反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)釜冷卻至室溫后離心洗滌，最后加水稀釋備用。

1.5 電極的組裝過(guò)程

首先，將玻碳電極用三氧化鋁粉末在電極板上打磨光滑，然后在水和乙醇的混合溶液中超聲清洗3次，室溫下晾干備用。用移液槍吸取10 μL分散均勻的紅熒烯納米材料（SDS-Rub）滴涂于預(yù)處理后的玻碳電極表面，在常溫避光條件下晾干成膜。然后用移液槍吸取5 μL分散均勻的銀納米線溶液滴涂于電極上，室溫避光條件下成膜。取10 μL Ab1滴涂于電極上，在4℃條件下孵育12 h。將孵育了Ab1的電極取出用蒸餾水淌洗，在室溫條件下滴涂5 μL牛血清白蛋白（BSA 0.25%），孵育40 min，用以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用蒸餾水淌洗之后室溫下孵育10 μL不同濃度的β淀粉樣蛋白（Aβ）1.5 h，最后用蒸餾水淌洗后室溫下孵育10 μL二茂鐵二抗復(fù)合物 （Fc-Ab2）1.5 h。電極組裝過(guò)程如圖1所示。

1.6 檢測(cè)方法

該實(shí)驗(yàn)測(cè)量采用三電極體系：

a）經(jīng)修飾的玻碳電極（Φ=4 mm）作為工作電極，Ag/AgCl（飽和 KCl溶液）作為參比電極，鉑絲為對(duì)電極。在2 mL PBS（pH=7.4）溶液中加入10 μL三乙胺（TEA)作為共反應(yīng)試劑，采用MPIA型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對(duì)所修飾電極的電致化學(xué)發(fā)光行為進(jìn)行研究。電位掃描范圍為0 V~1.2 V，以100 mV/s的電位掃描速度進(jìn)行掃描。

圖1 電級(jí)組裝過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the ECL sensor preparation process

b）經(jīng)修飾的玻碳電極（Φ=4 mm）作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲為對(duì)電極。在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中利用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)交流阻抗技術(shù)（EIS）對(duì)電極的制備過(guò)程進(jìn)行表征。電位區(qū)間為-0.2 V~0.6 V，掃描速率為50 mV/s。

圖2 紅熒烯納米材料和銀納米線的SEM表征Fig.2 SEM images of(A)SDS-Rub and(B)Ag nano wires

2 結(jié)果與討論

2.1 紅熒烯納米材料（SDS-Rub）和銀納米線的SEM表征

紅熒烯納米材料和銀納米線的掃描電子顯微鏡（SEM）表征如圖2所示，通過(guò)該圖可以看出紅熒烯納米材料和銀納米線的形貌特征。紅熒烯為長(zhǎng)度5 μm，截面直徑為1 μm的圓柱體形狀，銀納米線為長(zhǎng)度500 nm，截面直徑為50 nm的線狀，說(shuō)明該納米材料制備成功。

2.2 傳感器制備過(guò)程CV表征

制備過(guò)程中，修飾每一步電極后將其置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中，在-0.2~0.6V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安的電化學(xué)表征，由圖3可觀察到，裸電極在底液中有一對(duì)可逆的Fe(CN)64-/Fe(CN)63-的可逆氧化還原峰（曲線a）。當(dāng)紅熒烯納米材料固載到電極表面后，由于紅熒烯納米材料阻礙電子傳遞使得電流信號(hào)減弱（曲線b）。電極經(jīng)銀納米線修飾后，由于銀納米線加快電子傳遞，所以電流值增高（曲線c）。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)對(duì)電子傳遞的阻礙作用，當(dāng)分別修飾Ab1，BSA及Aβ 之后，電流強(qiáng)度依次降低（曲線 d、e、f）。 最后電極經(jīng)Fc-Ab2修飾之后，電流值增高（曲線g）。

圖3 CV表征（a.裸電極，b.SDS-Rub/裸電極，c.AgNWs/SDS-Rub/裸電極，d.Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，e.BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，f.Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，g.Fc-Ab2/Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極）Fig.3 The CV characterization(a.bare GCE,b.SDS-Rub/GCE,c.AgNWs/SDS-Rub/GCE,d.BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE,e.Ab1/BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE,f.Aβ/Ab1/BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE,g.Fc-Ab2/Aβ/Ab1/BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE)

2.3 傳感器制備過(guò)程ECL表征

電極制備過(guò)程中通過(guò)ECL信號(hào)的變化表征傳感器的修飾過(guò)程 （如圖4）。在2.0 mL三乙胺(TEA)溶液中，裸電極幾乎沒(méi)有信號(hào)（曲線a），當(dāng)電極修飾了紅熒烯納米材料后，ECL信號(hào)明顯增強(qiáng)（曲線b），因?yàn)殡姌O修飾了發(fā)光體紅熒烯。由于銀納米線對(duì)電子傳遞的促進(jìn)作用，因此ECL信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)（曲線c）。當(dāng)分別修飾上捕獲抗體、牛血清白蛋白、β淀粉樣蛋白、二茂鐵二抗復(fù)合物后，信號(hào)均降低（曲線 d、e、f、g），這是由于蛋白質(zhì)電子傳遞的阻礙作用。

圖 4 ECL 表征（a.裸電極，b.SDS-Rub/裸電極，c.AgNWs/SDS-Rub/裸電極，d.Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，e.BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，f.Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，g.Fc-Ab2/Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極）Fig.4 The ECL characterization(a.bare GCE,b.SDSRub/GCE,c.AgNWs/SDS-Rub/GCE,d.Ab1/AgNWs/SDSRub/GCE,e.BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/GCE,f.Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/GCE,g.Fc-Ab2/Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/GCE)

2.4 傳感器制備過(guò)程EIS表征

該實(shí)驗(yàn)還采用了電化學(xué)阻抗方法（EIS）來(lái)進(jìn)一步表征傳感器的制備過(guò)程。如圖5所示，不同修飾電極在含有0.1 mol/L KCl的[Fe(CN)6]3-/4-（5 mmol/L）溶液中掃描得到不同的電化學(xué)阻抗曲線。首先，裸電極具有比較小的阻抗值（曲線a），當(dāng)電極經(jīng)過(guò)紅熒烯納米材料修飾之后，阻抗值增大（曲線b），這是由于紅熒烯納米材料對(duì)電子的阻礙作用。將銀納米線固載到電極表面后，由于銀納米線加快電子傳遞，電化學(xué)阻抗值減小（曲線c）。由于蛋白質(zhì)的阻礙作用，連續(xù)孵育捕獲抗體、牛血清白蛋白、β淀粉樣蛋白后，阻抗值逐步增大（曲線d、e、f）。最后電極修飾上二茂鐵二抗復(fù)合物，電極阻抗值減小（曲線g）。

2.5 傳感器的ECL信號(hào)響應(yīng)特性

圖 5 ECL 表征（a.裸電極，b.SDS-Rub/裸電極，c.AgNWs/SDS-Rub/裸電極，d.Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，e.BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，f.Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極，g.Fc-Ab2/Aβ/BSA/Ab1/AgNWs/SDS-Rub/裸電極）Fig.5 The ECL characterization(a.bare GCE,b.SDSRub/GCE,c.AgNWs/SDS-Rub/GCE,d.BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE,e.Ab1/BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE,f.Aβ/Ab1/BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE,g.Fc-Ab2/Aβ/Ab1/BSA/AgNWs/SDS-Rub/GCE)

該實(shí)驗(yàn)研究了制備的免疫傳感器在孵育了不同濃度的抗原之后，其ECL信號(hào)與不同濃度抗原的關(guān)系，結(jié)果如圖6所示。從圖6A可以看出傳感器的發(fā)光強(qiáng)度隨孵育的抗原濃度的增大而減小。并且傳感器的發(fā)光強(qiáng)度與抗體的濃度成線性關(guān)系，如圖6B所示：線性方程為I=1372.81 lgc+8108.71(I為電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，c為β淀粉樣蛋白的濃度)，相關(guān)系數(shù)為r=0.998。所以此結(jié)果能很好地說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所制備的傳感器有很好的靈敏度。

2.6 ECL傳感器選擇性

為了探究傳感器對(duì)β淀粉樣蛋白的選擇性，將β淀粉樣蛋白分別用100 ng/mL的AFP、CEA及其混合物替代10 ng/mL進(jìn)行試驗(yàn)，然后將分別孵育了上述物質(zhì)的傳感器的電致化學(xué)發(fā)光響應(yīng)同孵育了10 ng/mL的β淀粉樣蛋白的信號(hào)進(jìn)行比較。結(jié)果如圖7所示，由于該傳感器為信號(hào)減小型，所以由圖7可以看出孵育β淀粉樣蛋白的傳感器ECL信號(hào)明顯小于其他對(duì)比蛋白。因此可以表明傳感器對(duì)β淀粉樣蛋白有很好的選擇性。

圖6 （A）不同濃度β淀粉樣蛋白的ECL響應(yīng)信號(hào)和（B）不同濃度β淀粉樣蛋白的線性曲線Fig.6 (A)The ECL profiles of the prepared biosensor in the presence of different concentrations of Aβ:a.blank，b.10 fg/mL， c.100 fg/mL，d.1 pg/mL，e.10 pg/mL，f.100 pg/mL，g.1 ng/mL，h.10 ng/mL，i.100 ng/mL and(B)The corresponding calibration plot of the ECL intensity vs.the logarithm of Aβ concentration

2.7 ECL傳感器的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是檢測(cè)傳感器性能的一個(gè)重要指標(biāo)。為測(cè)定該實(shí)驗(yàn)所制作的傳感器的穩(wěn)定性，在β淀粉樣蛋白濃度為100 ng/mL的條件下用電致化學(xué)發(fā)光儀在檢測(cè)液中連續(xù)循環(huán)掃描一段時(shí)間，所得出的ECL信號(hào)結(jié)果如圖8。由圖可以看出該傳感器的ECL信號(hào)非常穩(wěn)定，傳感器具有良好的性能。

圖7 傳感器的選擇性Fig.7 The selectivity of sensor:a.blank，b.AFP(100 ng/mL)，c.CEA(100 ng/mL)，d.Aβ (10 ng/mL)，e.the mixture

圖8 傳感器的ECL信號(hào)穩(wěn)定性圖Fig.8 The ECL signal stability of the biosensor towards 1×10-4ng/mL Aβ

2.8 各種檢測(cè)方法的對(duì)比

檢測(cè)方法間接法酶聯(lián)免疫吸附法雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附法該實(shí)驗(yàn)所研究的免疫傳感器優(yōu)點(diǎn)及不足僅在患者腦脊液(CSF)中檢測(cè)β淀粉樣蛋白，檢測(cè)方法比較局限但是具有較高的靈敏度能檢測(cè)Aβ 1-42的水平，對(duì)其他種類Aβ檢測(cè)效果不理想無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原檢出限低靈敏度好，再生性良好，成本低操作簡(jiǎn)便檢出限3.62 μg/L 2.02 μg/L 3.61 μg/L 3.2 fg/mL

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)以紅熒烯納米材料/三乙胺為發(fā)光體系，基于抗原抗體特異性結(jié)合采用夾心免疫模式構(gòu)建高靈敏的信號(hào)減小型ECL免疫傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在β淀粉樣蛋白濃度范圍10 fg/mL～100 ng/mL之間，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。該ECL生物傳感器制備方法簡(jiǎn)單，能夠?qū)Ζ碌矸蹣拥鞍讓?shí)現(xiàn)高靈敏度，高選擇性的檢測(cè)，并且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，能夠更方便更快速地檢測(cè)低濃度的β淀粉樣蛋白，有望在醫(yī)療等方面中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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The electrochemiluminescence immunosensor based on the rubrene nanomaterials for sensitive detection of amyloid-β protein

Liu Jia-li,Tang Yu-heng,Zhuo Ying*,Chai Ya-qin,Yuan Ruo*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

國(guó)家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目（21575116,21675129,21675130）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（XDJK2015A002）

*通信聯(lián)系人，E-mail:yingzhuo@swu.edu.cn;yuanruo@swu.edu.cn,Tel.:Fax:023-68253172（卓穎，袁若）