化濕行瘀清熱方治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變后HSP90α、Ki-67的表達(dá)及意義

張鵬飛，劉 健，劉鐵軍， 許彥枝*

(1.河北省胸科醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050011)

·論著·

化濕行瘀清熱方治療金黃地鼠頰黏膜癌前病變后HSP90α、Ki-67的表達(dá)及意義

張鵬飛1，劉 健2，劉鐵軍2， 許彥枝2*

(1.河北省胸科醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050011)

目的探討金黃地鼠頰黏膜癌前病變經(jīng)化濕行瘀清熱方治療前后熱休克蛋白(heat shock protein 90α,HSP90α)、Ki-67的表達(dá)及臨床意義。方法60只金黃地鼠用二羥甲基丁酸(dimethylolbutanoie acid，DMBA)丙酮溶液涂抹6周全部制作成金黃地鼠頰黏膜癌前病變的動(dòng)物模型，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組30只應(yīng)用化濕行瘀清熱方行灌胃療法8周，對(duì)照組30只應(yīng)用生理鹽水灌胃8周，采用免疫組織化學(xué)SP法觀察2組口腔黏膜的形態(tài)變化，應(yīng)用染色強(qiáng)度評(píng)價(jià)HSP90α、Ki-67的表達(dá)水平。結(jié)果灌胃后實(shí)驗(yàn)組Ki-67陽性表達(dá)率為23.3%(7/30)，對(duì)照組Ki-67陽性表達(dá)率為80.0%(24/30)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；灌胃后實(shí)驗(yàn)組HSP90α陽性表達(dá)率為20.0%(6/30)，對(duì)照組HSP90α陽性表達(dá)率為76.7%(23/30)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論化濕行瘀清熱方對(duì)DMBA誘發(fā)的金黃地鼠口腔黏膜癌前病變有一定的逆轉(zhuǎn)作用。

癌前狀態(tài)；熱休克蛋白質(zhì)類；Ki-67；化濕行瘀清熱方

近年來，口腔黏膜癌前病變的發(fā)病率逐年提高。其發(fā)病原因涉及全身因素及局部因素。若口腔黏膜癌前病變可以被早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行積極治療，往往可以取得滿意的預(yù)后[1]。有研究發(fā)現(xiàn)化濕行瘀清熱方對(duì)口腔黏膜癌前病變有特定的治療作用[2]。二羥甲基丁酸(dimethylolbutanoieacid，DMBA)誘導(dǎo)的金黃地鼠頰黏膜癌是目前口腔腫瘤研究的理想模型。本研究采用DMBA誘導(dǎo)的金黃地鼠頰黏膜癌作為模型，模擬人口腔黏膜癌前病變的發(fā)生、發(fā)展過程，應(yīng)用中藥化濕行瘀清熱方對(duì)金黃地鼠頰黏膜癌前病變進(jìn)行處理，以免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)其治療前后熱休克蛋白(heatshockprotein90α,HSP90α)、Ki-67的表達(dá)，旨在探討中藥化濕行瘀清熱方對(duì)金黃地鼠口腔黏膜癌前病變的逆轉(zhuǎn)作用，報(bào)告如下。

1 材 料 與 方 法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 選取金黃地鼠60只，鼠齡6周，體質(zhì)量260～300g， 雌雄比例1∶1。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由食水，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境2d后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，操作過程符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。60只地鼠頰黏膜用0.5%DMBA涂藥，每周3次，連續(xù)涂藥6周，建立口腔黏膜癌前病變動(dòng)物模型。涂藥后禁食、水2h，口腔癌前病變標(biāo)準(zhǔn)符合1978年WHO對(duì)口腔癌前病變的判定標(biāo)準(zhǔn)：雙側(cè)頰黏膜肉眼觀全部為充血、糜爛、條索狀皺折等表現(xiàn)，HE染色后觀察可見不同程度的異常增生，表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)異常，如過角化、粒層明顯、棘層增厚、基底細(xì)胞復(fù)層、核濃染、上皮釘突肥大等。60只金黃地鼠隨機(jī)分為：實(shí)驗(yàn)組30只，應(yīng)用化濕行瘀清熱方(主要由砂仁6g、佩蘭10g、黃柏10g、赤芍9g、紅花9g、蟬蛻10g等組成，每日1劑，分早晚2次服用)[3]灌胃治療，所需材料購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中藥房；對(duì)照組30只，進(jìn)行生理鹽水灌胃處理。

1.2 灌胃與取材方法 實(shí)驗(yàn)組灌胃前禁食、水8h，待動(dòng)物停涂DMBA1周后，立即采取化濕行瘀清熱方灌胃療法1次/d。對(duì)照組應(yīng)用生理鹽水灌洗。連續(xù)灌洗8周后，將動(dòng)物處死于同側(cè)頰黏膜處切取相同大小(1.0cm×1.5cm×0.1cm)病變組織及相鄰的正常黏膜組織。用10%甲醛溶液將標(biāo)本固定。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法，按試劑盒說明操作。兔抗鼠Ki-67單克隆抗體和兔抗鼠HSP90ɑ單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，封片后由2位資深病理科醫(yī)師在雙盲情況下評(píng)價(jià)隨機(jī)的5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。然后根據(jù)半定量積分法將染色強(qiáng)度分為4個(gè)級(jí)別：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比分5級(jí)：<5%為0分；5%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%為4分。每張切片最后的得分為2次評(píng)分相加所得的總分[0～1分計(jì)為(-)，2～3 分計(jì)為(+)，4～5分計(jì)為(++)，6～7分計(jì)為(+++)]。以(-)定位陰性，以(+)、(++)、(+++)分別定位弱陽性、陽性和強(qiáng)陽性。分別設(shè)立陰性對(duì)照及陽性對(duì)照：以PBS替代一抗的正?？谇火つど掀と旧Y(jié)果作為陰性對(duì)照；以試劑自帶陽性片染色結(jié)果作為陽性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌前病變模型的形態(tài)變化 未經(jīng)DMBA丙酮接觸地鼠頰黏膜表面光滑呈淡粉色，透亮具有彈性，血管清晰，鏡下觀察可見角化的復(fù)層鱗狀上皮，薄層結(jié)締組織、纖維細(xì)胞及血管位于上皮和肌層之間(圖 1)。經(jīng)DMBA丙酮溶液接觸6周后，肉眼觀可見雙側(cè)頰黏膜表現(xiàn)為充血、糜爛，HE染色后鏡下觀察地鼠頰黏膜可見不同程度的異常增生，表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)異常?？梢姴灰?guī)則分層的上皮、喪失極性的基底細(xì)胞、核分裂次數(shù)增加、異常淺層分裂及釘突內(nèi)角化珠等；細(xì)胞核變大，形狀不規(guī)則且染色質(zhì)增多，累及上皮層的下1/2～2/3(圖 2)。結(jié)果顯示，輕度異常增生24只，中度異常增生30只，重度異常增生6只。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：HSP90α染色陽性呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞漿(圖3～5)；Ki-67染色陽性呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞核，胞漿為陰性(圖6～8)。

圖1 地鼠頰黏膜在接觸DMBA之前的表現(xiàn)(HE染色×200)Figure1 Buccalmucosaofthecasesbe-forethecontactofDMBA(HE×200)圖2 地鼠頰黏膜在接觸DMBA之后的表現(xiàn)(HE染色×200)Figure2 BuccalmucosaofthehamstersaftercontactofDMBA(HE×200)圖3 接觸DMBA溶液之后HSP90α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

Figure3TheexpressionofHSP90αaftercontactofDMBA(SP×200)

圖4化濕行瘀清熱方灌胃治療后HSP90α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

Figure4TheexpressionofHSP90αaftergavageofHuashiXingyuQingredecoction(SP×200)

圖5生理鹽水灌胃治療后HSP90α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

Figure5TheexpressionofHSP90αaftergavageofsaline(SP×200)

圖6接觸DMBA溶液之后Ki-67的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

Figure6TheexpressionofKi-67aftercontactofDMBA(SP×200)

圖7化濕行瘀清熱方灌胃治療后Ki-67的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

Figure7TheexpressionofKi-67aftergavageofHuashiXingyuQingredecoction(SP×200)

圖8生理鹽水灌胃治療后Ki-67的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

Figure8TheexpressionofKi-67aftergavageofsaline(SP×200)

2.2 2組地鼠治療前后Ki-67和HSP90α表達(dá) 2組地鼠接觸DMBA丙酮溶液成模后(治療前)，實(shí)驗(yàn)組Ki-67陽性表達(dá)率為80.0%(24/30),對(duì)照組Ki-67陽性表達(dá)率為76.7%(23/30)，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；灌胃后實(shí)驗(yàn)組Ki-67陽性表達(dá)率為23.3%(7/30)，對(duì)照組Ki-67陽性表達(dá)率為80.0%(24/30)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2組地鼠接觸DMBA丙酮溶液成模后(治療前)，實(shí)驗(yàn)組HSP90α 陽性表達(dá)率為70.0%(21/30)，對(duì)照組HSP90α陽性表達(dá)率73.3%(22/30)，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；灌胃后實(shí)驗(yàn)組HSP90α陽性表達(dá)率為20.0%(6/30)，對(duì)照組HSP90α陽性表達(dá)率為76.7%(23/30)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組經(jīng)DMBA丙酮液體處理后SP90α和Ki-67表達(dá)情況Table 1 The expression of HSP90α and Ki-67 in two groups after the treatment of DMBA-acetone (n=30，例數(shù))

3 討 論

口腔黏膜癌前病變是指細(xì)胞異常增生，具有惡性變化傾向。其發(fā)病與局部因素(吸煙、喜飲烈性酒、咀嚼檳榔、不良修復(fù)體、殘根殘冠的銳利邊緣對(duì)局部黏膜的機(jī)械刺激)的長(zhǎng)期刺激以及某些全身因素(念珠菌感染、微量元素缺乏、微循環(huán)改變、易感的遺傳素質(zhì)、脂溶性維生素缺乏等)有關(guān)。由于口腔黏膜癌前病變?cè)虿幻髑乙讓?dǎo)致癌變，故早期對(duì)口腔黏膜癌前病變進(jìn)行處理尤為重要。

目前，對(duì)于口腔黏膜癌前病變尚無特效治療方法，尤其是對(duì)于病變部位多發(fā)或病變面積較大的患者。西醫(yī)療效不穩(wěn)定，僅能緩解臨床癥狀，無法從根本上解決問題。近年來，某些中草藥在治療口腔黏膜癌前中發(fā)揮了顯著的作用。國(guó)內(nèi)部分學(xué)者對(duì)單玄口膠、1023中藥合劑、復(fù)方半枝蓮、復(fù)方絞股藍(lán)、增生平、燈盞細(xì)辛等中成藥及天然胡蘿卜素、大蒜、蘆薈、螺旋藻等天然保健食品防治口腔癌前病變作用進(jìn)行了相應(yīng)的研究[4]?；瘽裥叙銮鍩岱接星鍩嵩餄?、健脾化濕、清熱涼血、質(zhì)輕善散、止癢等功效。其中蟬蛻除含有17種氨基酸外，還包含多種人體不可缺少的微量元素，對(duì)促進(jìn)口腔黏膜病變有特定的作用[5]；黃柏清熱涼血、健脾化濕，有抑菌抗炎、促進(jìn)組織愈合的功效；佩蘭解熱清暑、健脾利濕，具有抗炎殺菌作用；甘草可以去除不正之氣及瀉火，健脾胃而和中，解百毒，協(xié)和諸藥；丹參、赤芍等可通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)部免疫系統(tǒng)達(dá)到自穩(wěn)的狀態(tài)[3]，赤芍還可以在一定程度上降低血液黏度，改善微循環(huán)及血管通透性，進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞的修復(fù)?；瘽裥叙銮鍩岱降纳鲜鰞?yōu)點(diǎn)對(duì)口腔黏膜癌前病變有一定的治療作用。

HSP90α基因位于人類染色體14q32.33，有11個(gè)外顯子，其編碼產(chǎn)物是732個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為90 000。HSP90α的主要生物學(xué)功能包括“分子伴侶”作用、在細(xì)胞調(diào)節(jié)的“多成分伴侶”途徑中的作用、體外ATP酶活性及自我磷酸化作用、免疫功能和抗凋亡與凋亡調(diào)節(jié)作用等。其中免疫功能和抗凋亡、凋亡調(diào)節(jié)作用與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6-8]。作為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)，HSP90α蛋白在維持多種腫瘤蛋白的正常結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性方面均發(fā)揮著不可替代的作用。

Ki-67是在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，基因位于10號(hào)染色體上[9-10]。它是一個(gè)大分子質(zhì)量的蛋白，在除G0期外的細(xì)胞周期內(nèi)表達(dá)，于細(xì)胞周期啟動(dòng)時(shí)開始增加，在S期的后半部分表達(dá)顯著增強(qiáng)，于G2和M期達(dá)到峰值，在有絲分裂結(jié)束后又迅速下降[11-12]。其與細(xì)胞增殖過程有關(guān)。在人類諸多癌前病變中，均存在Ki67過度表達(dá)的現(xiàn)象[13]。因此，許多學(xué)者推斷Ki-67是人類所有增殖細(xì)胞中普遍存在的標(biāo)志性抗原，且對(duì)組織細(xì)胞惡變的識(shí)別具有一定的意義。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了HSP90α、Ki-67在各組中的表達(dá)情況。正常地鼠頰黏膜HSP90α、Ki-67的陽性表達(dá)主要見于基底細(xì)胞層[14-15]。DMBA致癌6周后，HSP90α、Ki-67的表達(dá)由基底層逐漸擴(kuò)展至棘層，乃至上皮全層，進(jìn)而使得HSP90α、Ki-67陽性表達(dá)率明顯升高，這種現(xiàn)象的發(fā)生與DMBA作用后上皮組織學(xué)變化的類型有關(guān)[16-17]。中藥化濕行瘀清熱方灌胃治療后HSP90α、Ki-67的陽性表達(dá)明顯降低，而生理鹽水灌胃治療后HSP90α、Ki-67陽性表達(dá)無明顯變化。表明化濕行瘀清熱方對(duì)金黃地鼠頰黏膜癌前病變有一定的逆轉(zhuǎn)作用。有研究發(fā)現(xiàn)HSP90α、Ki-67的表達(dá)與口腔黏膜癌前病變治療的進(jìn)程呈正相關(guān)性[18]，但其具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步深入探討。

總之，中藥化濕行瘀清熱方對(duì)DMBA誘發(fā)的金黃地鼠口腔癌前病變有一定的逆轉(zhuǎn)作用，其作用機(jī)制還不完全清楚，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥研究方面的應(yīng)用，中藥化濕行瘀清熱方的作用機(jī)制將會(huì)更明了。

[1] Yang JG,Lu R,Ye XJ,et al. Icaritin reduces oral squamous cell carcinoma progression via the inhibition of STAT3 signaling[J]. Int J Mol Sci,2017,18(1):132.

[2] Yu CC,Yu CH,Chang YC. Aberrant SSEA-4 upregulation mediates myofibroblast activity to promote pre-cancerous oral submucous fibrosis[J]. Sci Rep,2016,6:37004.

[3] 劉揚(yáng),孔祥民.中藥有效成分分析的新方法新技術(shù)研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué),2012.

[4] 楊昆.大蒜為什么能有效防癌[J].科學(xué)養(yǎng)生,2015,(11):13-14.

[5] 孫華娟.淺談蟬蛻的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中外健康文摘,2013,10(8):401-402.

[6] Taiyab A,Rao ChM. HSP90 modulates actin dynamics: inhibition of HSP90 leads to decreased cell motility and impairs invasion[J]. Biochim Biophys Acta，2011，1813(1):213-221.

[7] Khalili M,Mahdavi N,Beheshti R,et al. Immunohistochemical evaluation of angiogenesis and cell proliferation in tongue squamous cell carcinoma [J]. J Dent (Tehran),2015,12(11):846-852.

[8] Bryan RT,Zeegers MP,James ND,et al. Biomarkers in bladder cancer [J]. BJU Int,2010,105(5):608-613.

[9] 趙爾揚(yáng),方明,施磊,等.增殖細(xì)胞核抗原和Ki67在口腔癌浸潤(rùn)前沿表達(dá)及意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2008,24(5):495-497.

[10] Calil LN,Igansi CN,Meurer L,et al. Chlamydia trachomatis and human papillomavirus coinfection: association with p16INK4a and Ki67 expression in biopsies of patients with pre-neoplastic and neoplastic lesions[J]. Braz J Infect Dis,2011,15(2):126-131.

[11] ?hman J,Magnusson B,Telemo E,et al. Langerhans cells and T cells sense cell dysplasia in oral leukoplakias and oral squamous cell carcinomas--evidence for immunosurveillance[J]. Scand J Immunol,2012,76(1):39-48.

[12] Ujwala N,Singh NA,Milind N,et al. Colposcopy in pre-malignant lesions and oral squamous cell carcinoma: Linking threads of clinical,histopathological and colposcopic inferences [J]. J Cancer Res Ther,2016,12(1):295-301.

[13] Qian XL,Zhang J,Li PZ,et al. Dasatinib inhibits c-src phosphorylation and prevents the proliferation of Triple-Negative Breast Cancer (TNBC) cells which overexpress Syndecan-Binding Protein (SDCBP)[J]. PLoS One,2017,12(1):e0171169.

[14] Kimura Y,Sumiyoshi M,Kobayashi T. Whey peptides prevent chronic ultraviolet B radiation-induced skin aging in melanin-possessingmale hairless mice [J]. J Nutr,2014,144(1):27-32.

[16] Schmidt C,Beilsten-Edmands V,Robinson CV. The joining of the Hsp90 and Hsp70 chaperone cycles yields transient interactions and stable intermediates: insights from mass spectrometry[J]. Oncotarget，2015，6(21):18276-18281.

[17] 徐彥彬,劉莉,郭霞,等.135例口腔扁平苔蘚治療中的臨床護(hù)理[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(1):113-114.

[18] 許彥枝,王丹,劉健.蘚化飲對(duì)體外培養(yǎng)的人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖活性的影響[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(12):1292-1295.

(本文編輯：許卓文)

TheexpressionsandsignificanceofHSP90αandKi-67ingoldenhamsterbuccalmucosaprecancerouslesionsafterHuashiXingyuQingredecoctiontreatment

ZHANGPeng-fei1,LIUJian2,LIUTie-jun2,XUYan-zhi2*

(1.DepartmentofStomatology,theChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China; 2.DepartmentofStomatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveTo investigate the expressions and significance of heat shock protein 90α, HSP90α)and Ki-67 in hamster buccal mucosa precancerous lesions after Huashi Xingyu Qingre decoction treatment.MethodsSixty golden hamster models of buccal mucosa precancerous lesions were established after the contact of dimethylolbutanoie acid(DMBA) for six weeks. They were randomly divided into experimental and control groups. Thirty rats of experimental group were received gavage therapy of Huashi Xingyu Qingre decoction for 8 weeks, while, the other thirty rats of control group were received normal saline treatment for 8 weeks. The expression levels of HSP90α、Ki-67 were assessed by dyeing intensity of streptavidin-perosidase(SP).ResultsThe positive expression rate of Ki-67 after gavage was 23.3%(7/30) in the experimental group and 80.0%(24/30) in the control group(P<0.01). The positive expression rate of HSP90α after gavage was 20.0%(6/30) in the experimental group and 76.7%(23/30) in the control group(P<0.01).ConclusionHuashi Xingyu Qingre decoction is conspicuously effective in the reversal of DMBA-induced precancerous lesions in the hamster buccal mucosa.

precancerouslesions;heat-shockproteins;Ki-67;HuashiXingyuQingredecoction

R730.21

A

1007-3205(2017)10-1180-05

2017-02-17；

2017-04-18

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃(2016175)

張鵬飛(1981-)，男，山西運(yùn)城人，河北省胸科醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔修復(fù)研究。

*通訊作者。E-mail：xu_yanzhi@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.015