夾脊電針對(duì)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P38 MAPK影響的研究*

衛(wèi) 彥,杜劍麗,寇吉友,孫遠(yuǎn)征,孫忠人

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

夾脊電針對(duì)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P38 MAPK影響的研究*

衛(wèi) 彥1,杜劍麗1,寇吉友2△,孫遠(yuǎn)征2,孫忠人1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：通過(guò)夾脊電針對(duì)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的干預(yù)，觀察其對(duì)小鼠腰髓脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P38、P-P38表達(dá)，旨在證實(shí)針刺對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，為夾脊電針治療肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：選取ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠18只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將其分為電針組、手針組、模型組，每組各6只，陰性對(duì)照組選取同窩野生型小鼠6只。在小鼠出生后第60天開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)。電針組：雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴針刺，疏波刺激；手針組：雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴針刺，每10 min捻轉(zhuǎn)1次；模型組、陰性對(duì)照組：同一時(shí)間，同一時(shí)長(zhǎng)抓握、捆綁處理。共4周。小鼠出生120天時(shí)進(jìn)行P-P38MAPK、P38MAPK免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，并用圖像分析儀對(duì)每張圖片陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度(mean density)及累積光密度(IOD)進(jìn)行測(cè)定和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：模型組P-P38、P38表達(dá)及P-P38/P38比值均明顯比陰性對(duì)照組升高，且具有極顯著性差異(P<0.01)。與模型組和手針組相比，電針組表達(dá)明顯降低(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，雖然手針組比值有所降低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明夾脊電針可以明顯降低ALS-G93A小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P-P38、P38表達(dá)及P-P38/P38比值。結(jié)論：夾脊電針對(duì)發(fā)病中期的ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P-P38表達(dá)有下調(diào)作用,抑制P38MAPK的活化，從而起到有效保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用。

ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠；夾脊穴；電針；P38MAPK

肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)是臨床上最常見(jiàn)的一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，該病是一種既累及上單位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(大腦皮質(zhì)、錐體束)又累及下單位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核、脊髓前角細(xì)胞)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其特點(diǎn)為肌肉無(wú)力、萎縮及肌束震顫，且廣泛性發(fā)生，同時(shí)伴有錐體束征。ALS的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，目前研究可能涉及氧化應(yīng)激[1]、細(xì)胞興奮性氨基酸毒性[2]、線粒體的功能障礙[3]、蛋白質(zhì)異常聚集及錯(cuò)誤折疊[4]、神經(jīng)炎性反應(yīng)[5]、凋亡[6]、非運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元參與[7]、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺失和異常[8]及神經(jīng)絲異常磷酸化[9]等。利魯唑(Riluzole)可以一定程度上提高患者的生存期，但價(jià)格昂貴，較難大范圍應(yīng)用于臨床。筆者發(fā)揮中醫(yī)針灸特色，運(yùn)用夾脊電針治療本病，療效甚佳。因此以ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠為載體，進(jìn)行針刺實(shí)驗(yàn)研究，觀察小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P38、P-P38表達(dá)，揭示夾脊電針神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，為本方法的臨床推廣提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物繁殖擴(kuò)增及鑒定：于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)遺傳背景為C57BL/6J hmSOD1G93A/+半合子雄鼠和C57BL/6J陰性雌鼠，用于繁殖hmSOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性半合子小鼠。于新生小鼠第30天時(shí)，根據(jù)Jackson實(shí)驗(yàn)室所提供的引物以及鑒定方案，以白介素2(IL-2)為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因鑒定，再根據(jù)小鼠表型特征進(jìn)行表型鑒定。

選用ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，雌性，SPF級(jí)(購(gòu)于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，于黑龍江動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所，恒溫恒濕SPF級(jí)環(huán)境下繁殖飼養(yǎng))18只，隨機(jī)分為模型組、手針組和電針組，每組6只；同窩野生型小鼠6只，作為陰性對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

杏林牌針灸針(規(guī)格：0.07 mm×17 mm,天津華鴻醫(yī)材有限公司);長(zhǎng)城牌KWD-808電麻儀(杭州丹頓醫(yī)療器械有限公司);anti-P38 antibody RabbitmAb(Cell Signaling Technology 8690);anti-P-P38 antibody RabbitmAb (Cell Signaling Technology 4631);轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定配套引物(Jackson Lab);內(nèi)參IL-2 (forward)CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT(上海生工生物工程有限公司);內(nèi)參IL-2(reverse)GTAGGTGGA AAT TCTAGCATCATCC(上海生工生物工程有限公司);目的基因SOD1 (forward)(CATCAGCCCTAATCCATCTGA,上海生工生物工程有限公司);目的基因SOD1 (reverse)CGCGACTAACAATCAAAGTGA(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 治療方案

手針組：第60天開(kāi)始針刺，取雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴干預(yù)，每穴進(jìn)針2～3 mm，每10 min捻轉(zhuǎn)1次，每穴行針持續(xù)10 s，每次留針20 min，2次/周，共治療4周。

電針組：第60天開(kāi)始針刺，取雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴干預(yù)，每穴進(jìn)針2～3 mm，同一組電極連于脊柱同側(cè)，電極連接使電流方向與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)束方向一致，電針頻率為2 Hz，強(qiáng)度大小以小鼠下肢肌肉收縮為度，每次留針20 min，2次/周，治療4周。

模型組、陰性對(duì)照組均予以同一時(shí)間，同一時(shí)長(zhǎng)抓握、捆綁處理，共4周。

1.4 取材檢測(cè)

針刺結(jié)束待所有小鼠神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)1分后,120天時(shí)將小鼠腰膨大L1～6的腰髓取材，脫水，包埋蠟塊，切片，進(jìn)行P-P38MAPK 、P38MAPK免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，并對(duì)兩者的比值進(jìn)行比較。

1.5 圖片分析

將每只小鼠染色后的圖片隨機(jī)抽取3張進(jìn)行光鏡觀察，胞膜可見(jiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，采用Image pro-Plus 6.0對(duì)圖片進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)出每張圖片陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度和累積光密度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，如符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)則采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，組間兩兩比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行處理；如不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察并統(tǒng)計(jì)夾脊電針對(duì)小鼠腰髓的前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P-P38、P38表達(dá)，同時(shí)計(jì)算P-P38/P38比值。

2.1 各組小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38表達(dá)結(jié)果

見(jiàn)表1、封三彩圖1～4。表1體現(xiàn)的是免疫組織化學(xué)法觀察小鼠腰膨大脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P-P38的表達(dá)情況,模型組P-P38表達(dá)明顯比陰性對(duì)照組升高，且具有極顯著性差異(P<0.01);與模型組和手針組相比，電針組表達(dá)明顯降低(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，手針組P-P38數(shù)值略降低，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明夾脊電針治療ALS-SOD1G93A小鼠，可顯著降低鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38的表達(dá)。

表1 各組小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38表達(dá)比較

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與手針組比較，●P<0.05，●●P<0.01

2.2 各組小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P38表達(dá)結(jié)果

見(jiàn)表2、封三彩圖5～8。表2體現(xiàn)的是免疫組化法觀察小鼠腰膨大脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P38的表達(dá)情況，模型組P38表達(dá)明顯比陰性對(duì)照組升高，且具有極顯著性差異(P<0.01);與模型組和手針組相比，電針組表達(dá)明顯降低(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，手針組P38數(shù)值略降低，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明夾脊電針治療ALS-SOD1G93A小鼠，可顯著降低鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P38的表達(dá)。

表2 各組小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P38表達(dá)比較

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與手針組比較，●P<0.05，●●P<0.01

2.3 各組小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38/P38比值結(jié)果

見(jiàn)表3。表3體現(xiàn)的是免疫組化法觀察小鼠腰膨大脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38/P38的表達(dá)情況，模型組P-P38/P38比值明顯比陰性對(duì)照組升高，且具有極顯著性差異(P<0.01)；與模型組和手針組相比，電針組表達(dá)明顯降低(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，手針組P-P38/P38數(shù)值略降低，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明夾脊電針治療ALS-SOD1G93A小鼠，可顯著降低鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38/P38的比值。

表3 各組小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞P-P38/P38比值比較

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；與手針組比較，●P<0.05，●●P<0.01

3 討論

肌萎縮側(cè)索硬化是臨床的疑難重癥，雖發(fā)病率不高，但生存期較短。目前只有利魯唑(Riluzole)一種藥物被FDA認(rèn)可治療ALS，但是它只能延長(zhǎng)患者的平均生存期3個(gè)月，并不能治療本病或緩解癥狀，且連續(xù)用藥6個(gè)月以上將會(huì)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)性提高死亡率的不良結(jié)局[10]，價(jià)格昂貴，不利于臨床推廣。

肌萎縮側(cè)索硬化在中醫(yī)學(xué)中屬于“痿證”的范疇。自《黃帝內(nèi)經(jīng)》起，中醫(yī)學(xué)便有了“痿證”的論述，經(jīng)后代發(fā)揮實(shí)踐，將痿證定義為“痿弱縱緩而不能起立”；《針灸甲乙經(jīng)·熱在五臟發(fā)痿》中對(duì)痿證的描述：“足緩不收，痿不能行，不能言語(yǔ)，手足痿蹙不能行，地倉(cāng)主之?！迸c臨床肌萎縮側(cè)索硬化患者肢體無(wú)力、運(yùn)動(dòng)障礙合并構(gòu)音障礙癥狀表現(xiàn)相似。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化的病因病機(jī)有獨(dú)到見(jiàn)解[11-13]，在治療方面亦方法獨(dú)特[14-20]?！端貑?wèn)·痿論》中論述痿證治療時(shí)，提出治痿獨(dú)取陽(yáng)明。著名中醫(yī)王樂(lè)亭教授[21]治療痿證的多年實(shí)踐中提出了治痿“首取督脈”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，并在大量臨床實(shí)踐中得到了證實(shí)。華佗夾脊穴源于華佗“取背俞法”，位于背部督脈兩側(cè)，膀胱經(jīng)與督脈之間，可內(nèi)通督脈，外灌多氣多血之膀胱經(jīng)。因此，筆者應(yīng)用夾脊電針干預(yù)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，并對(duì)鼠腰髓的前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P38、P-P38表達(dá)進(jìn)行觀察，證實(shí)電針組優(yōu)于其他對(duì)照組，揭示夾脊電針神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，說(shuō)明夾脊電針這種綠色療法治療本病療效肯定，其方法簡(jiǎn)便易于操作，沒(méi)有毒副作用，利于在臨床上推廣。

4 結(jié)論

夾脊電針可以有效降低發(fā)病中期ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元P-P38MAPK的表達(dá)，抑制P38MAPK的活化，從而起到有效保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用。

[1] Morimoto N,Miyazaki K,Kurata T,et al.Effect of mitochondrial transcription factor a overexpression on motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis model mice[J].J Neurosci Res,2012,90(6):1200-1208

[2] Guo H,Lai L,Butchbach ME,et al.Increased expression of the glial glutamate transporter EAAT2 modulates excitotoxicity and delays the onset but not the outcome of ALS in Mice[J].Hum Mol Genet,2003,12(19):2519-2532

[3] Walczak J,Szczepanowska J.Dysfunction of mitochondrial dynamic and distribution in Amyotrophic Lateral Sclerosis[J].Postepy Biochem,2015,61(2):183-190

[4] Prell T,Lautenschllger J,Witte OW,et al.The unfolded protein response in models of human mutant G93A amyotrophic lateral sclerosis[J].Eur J Neurosci,2012,35(5):652-660

[5] Komine O,Yamanaka K.Neuroinflammation in motor neuron disease[J].Nagoya J Med Sci,2015,77(4):537-549

[6] Wood LK,Langford SJ.Motor neuron disease:a chemical perspective[J].J MedChem,2014,57(15):6316-6331

[7] Radford RA,Morsch M,Rayner SL,et al.The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia[J].Front Cell Neurosci,2015,27:414

[8] Krakora D,Mulcrone P,Meyer M,et al.Synergistic effects of GDNF and VEGF on lifespan and disease progression in a familial ALS rat model[J].Mol Ther,2013,21(8):1602-1610

[9] Ganesalingam J,An J,Bowser R,et al.pNfH is a promising biomarker for ALS[J].Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener,2013,14(2):146-149

[10] Cetin H,Rath J,Fuzi J,et al.Epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis and effect of riluzole on disease course[J].Neuroepidemiology,2015,44(1):6-15

[11] 黃紅梅,孫塑倫,高穎.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中醫(yī)研究現(xiàn)狀分析與思考[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003(2):65-67

[12] 謝仁明,王永炎.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中醫(yī)辨治及臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究思路[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003(5):22-25

[13] 王繼明,周順林.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中醫(yī)病名初探[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002(4):64

[14] 齊躍.肌萎靈注射液治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的療效分析[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2012(21):625-626

[15] 劉兆周.健脾補(bǔ)腎熄風(fēng)法治療肌萎縮側(cè)索硬化癥的臨床研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2005

[16] 葉永銘,林馳,田楠.韓碧英教授治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病經(jīng)驗(yàn)介紹[J].上海針灸雜志,2013,32(9):704-705

[17] 李婧.從肺脾論治對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化患者運(yùn)動(dòng)/生存功能的影響[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2012

[18] 展文國(guó).裴正學(xué)教授治療肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥1例報(bào)告[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2013(9):144

[19] 秦悅.王健教授治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[D].沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué),2013

[20] 李俊麗.鄭紹周教授從腎論治運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病經(jīng)驗(yàn)[J].中醫(yī)研究,2010(4):61-62

[21] 王樂(lè)亭.金針王樂(lè)亭[M].北京：北京出版社，1984:58

P38MAPKExpressioninMotorNeuronofAnteriorHornofLumberSpinalCordundertheTreatmentofElectro-acupunctureonJiajiPointsinALS-SOD1G93ATransgenicMice

WEI Yan1, DU Jian-li1, KOU Ji-you2△, SUN Yuan-zheng2, SUN Zhong-ren1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective：To observe the expression of P38, P-P38 in motor neuron of anterior horn of lumber spinal cord by electro-acupuncture on Jiaji points in ALS-SOD1G93Atransgenic mice, to prove acupuncture protective effect on neuron and to provide experimental basis for the acupuncture treatment for ALS.Methods18 ALS-SOD1G93A transgenic mice were randomly divided into the electro-acupuncture group, the acupuncture group, the model group, with six mice in each group; six wild-type mice were taken as negative control. The mice were intervened starting from 60 days after birth. The electro-acupuncture group was intervened with rarefaction wave on Jiaji points of L1～2, and L5～6; the acupuncture group was intervened with hand acupuncture on Jiaji points of L1～2, and L5～6, the frequency for the needle twirling was once every ten minutes; the model group and the negative control group were intervened with grasping and seizing at the same time for the same time length. The treatment course was four weeks. 120 days after birth, the mice were given immunohistochemical test, and the mean density and IOD were analyzed by image analyzer.ResultsThe expressions of P-P38 and P38, and the ratio of P-P38/P38 in the model group were significantly increased compared to the negative control group(P<0.01). The expressions was decreased in the electro-acupuncture group compared to those of the model group and the acupuncture group(P<0.01 orP<0.05), while there were no significant differences between the acupuncture group and the model group(P>0.05). It proved that electro-acupuncture could reduce the expressions of P-P38 and P38, as well as the ratio of P-P38/P38.ConclusionElectro-acupuncture on Jiaji points can down-regulate the expression of P-P38 in motor neuron of anterior horn of lumber spinal cord in the middle age of ALS-SOD1G93Atransgenic mice, and inhibit the activation of P38MAPK to protect the neuron.

ALS-SOD1G93Atransgenic mice; Jiaji points; Electro-acupuncture; P38MAPK

R246.6

A

1005-0779(2017)09-0060-04

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士后啟動(dòng)基金資助(2014年)。

衛(wèi)彥(1976-)，女，副主任醫(yī)師，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)中西醫(yī)結(jié)合臨床專業(yè)博士后流動(dòng)站在站博士后,主要從事針灸專業(yè)工作。

△通訊作者：寇吉友(1974-)，男，副主任醫(yī)師,主要從事中醫(yī)針灸專業(yè)工作。

2017-03-10