炮天雄和刨附片對(duì)小鼠免疫功能的影響

李夢(mèng)婷，胡婷婷，熊秋韻，繆璐琳，謝曉芳，彭成

·藥理毒理·

炮天雄和刨附片對(duì)小鼠免疫功能的影響

李夢(mèng)婷，胡婷婷，熊秋韻，繆璐琳，謝曉芳，彭成

目的：探討炮天雄與刨附片對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法：采用標(biāo)準(zhǔn)物提取法制備炮天雄、刨附片水煎液。取正常小鼠，分組后，給予灌胃炮天雄或刨附片5.0、2.5、1.25 g．kg-1，連續(xù)30天或15天，應(yīng)用碳粒廓清實(shí)驗(yàn)或臟器指數(shù)實(shí)驗(yàn)，考察炮天雄和刨附片對(duì)正常小鼠的非特異性免疫；此外，用不同劑量的炮天雄、刨附片水煎液灌胃免疫抑制小鼠11天，測(cè)定小鼠碳粒廓清吞噬能力、外周血細(xì)胞水平及肝、脾、胸腺臟器指數(shù)。結(jié)果：刨附片5.0 g．kg-1能顯著提高正常小鼠碳粒廓清指數(shù)K（P＜0.05）；炮天雄5.0、2.5、1.25 g．kg-1和刨附片5.0、2.5、1.25 g．kg-1對(duì)免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均有升高趨勢(shì)；刨附片2.5 g．kg-1能顯著性升高免疫低下小鼠的肝臟指數(shù)（P＜0.05）。結(jié)論：刨附片和炮天雄對(duì)正常小鼠和免疫低下小鼠有一定增強(qiáng)非特異性免疫功能的作用。

炮天雄；刨附片；免疫調(diào)節(jié)；非特異性免疫

附子（Radix Aconiti Lateralis Preparata）來源于毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的子根加工品[1]。附子藥用歷史悠久，是傳統(tǒng)的有毒中藥，隨著其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的揭示，人們掌握了其減毒和控毒的方法[2]，從而指導(dǎo)臨床合理、安全使用。附子屬溫里藥，具有回陽救逆，補(bǔ)火助陽，散寒止痛的功效?，F(xiàn)代藥理和臨床研究顯示，附子散寒止痛的作用與提高機(jī)體免疫功能有關(guān)。與之同時(shí)，現(xiàn)代炮制技術(shù)發(fā)展的介入，附子的炮制品種也不斷增加，其中附子新的炮制品——炮天雄、刨附片，是擬作為保健飲片的附子新產(chǎn)品，用以溫陽補(bǔ)腎。然而，按照目前保健功能的分類兩者的功能暫不清晰，有關(guān)二者的藥理研究報(bào)道罕見。增強(qiáng)免疫功能可能是炮天雄和刨附片的保健功能之一，故本實(shí)驗(yàn)擬采用正常小鼠和免疫低下小鼠模型，初步探究炮天雄和刨附片對(duì)免疫功能的作用。

1 材料

1.1 藥物

刨附片，炮天雄，均由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司提供。使用文獻(xiàn)法[3]制備成刨附片濃水煎液和炮天雄濃水煎液，-20℃儲(chǔ)存，實(shí)驗(yàn)前將刨附片和炮天雄濃溶液用純凈水分別稀釋至高劑量組0.50 g．mL-1，中劑量組0.25 g．mL-1，低劑量組0.125 g．mL-1，待用。陽性藥物：人參總皂苷，由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司提供；氣血康口服液，云南白藥集團(tuán)文山七花有限責(zé)任公司，批號(hào)WKB1505。注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)14032625。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重為(20±2)g或(15±2)g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（川）2013-19，檢疫后備用。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(TCM-2009-315)。

1.3 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫，G1103a)，全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀（美國(guó)T h e r m o公司，VARIOSKAN FLASH 2.4.3）；血細(xì)胞分析儀（日本光電儀器公司，MEK-6218K型）；1/10萬電子天平(日本島津，AU W220D型）；超純水儀(美國(guó)Millipore，Milli-Q Integral 3)；電子秤(中國(guó)衡展，K-100DCH)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó) CORNING 公司）。

1.4 試劑

中華墨汁（北京一得閣墨業(yè)有限責(zé)任公司）；檸檬酸三鈉（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20101026）；碳酸鈉（成都天華科技股份有限公司，批號(hào)20051111）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)M13082210）。

2 方法

2.1 正常成年小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α測(cè)定

取體重為(20±2)g健康昆明種小鼠，適應(yīng)環(huán)境后按體重分層隨機(jī)分為空白組、人參總皂苷組、刨附片高劑量組、刨附片中劑量組、刨附片低劑量組、炮天雄高劑量組、炮天雄中劑量組、炮天雄低劑量組，各組小鼠10只，雌雄各半。刨附片高、中、低劑量組分別給予刨附片水煎液5.00 g．kg-1、2.50 g．kg-1、1.25 g．kg-1每日灌胃1次，炮天雄高、中、低劑量組分別予炮天雄水煎液5.00 g．kg-1、2.50 g．kg-1、1.25 g．kg-1每日灌胃1次，人參總皂苷組灌胃人參總皂苷2.50 g．kg-1，空白對(duì)照組給予純凈水10 mL．kg-1，每日1次，連續(xù)30天。于末次給藥0.5 h后，對(duì)小鼠尾靜脈注射25%墨汁（0.1 mL．(10g)-1），注入后立即計(jì)時(shí)，分別于2 min、10 min時(shí)從小鼠眼后靜脈叢取血0.02 mL，立即將血液加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用紫外分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)光密度值（OD）。然后將小鼠處死，取小鼠的肝臟和脾臟，并用濾紙吸干表面的血液，用電子天平稱其重量，按下列公式計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α值，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析[4～6]。

K=(LogOD1-LogOD2)/（t2-tl）(ODl，OD2分別為吸光度，t為時(shí)間)

α=體重/(肝重+脾重)×K1/3

2.2 幼年小鼠免疫器官臟器指數(shù)測(cè)定

取體重為(15±2)g健康昆明種小鼠80只，雌雄各半。分組與給藥同“2.1”，每日灌胃1次，連續(xù)給藥15天。末次給藥1h后，稱取小鼠體重，脫頸椎處死小鼠，解剖取脾、肝精密稱重，計(jì)算小鼠的脾指數(shù)和肝指數(shù)。比較給藥組與空白組各臟器指數(shù)。臟器指數(shù)計(jì)算方法：

臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/小鼠體重(g)

2.3 免疫低下模型小鼠免疫功能測(cè)定

取體重為(20±2)g健康昆明種小鼠90只，適應(yīng)環(huán)境后按體重分層隨機(jī)分為空白組、模型組、氣血康口服液組、刨附片高劑量組、刨附片中劑量組、刨附片低劑量組、炮天雄高劑量組、炮天雄中劑量組、炮天雄低劑量組，各組小鼠10只，雌雄各半。各組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，10 mL．kg-1，每日1次，連續(xù)11天。除空白組外，其余各組于灌胃第1、3、5、7、9天，在灌胃前給予皮下注射環(huán)磷酰胺50 mg．kg-1。隔日稱重1次。分別于第5天和第10天給藥1.0 h后，各組小鼠眼后靜脈叢取血，采用血細(xì)胞分析儀測(cè)定外周血中白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）數(shù)量。第11天給藥0.5 h后，對(duì)小鼠尾靜脈注射25%墨汁（0.1 mL．(10g)-1），注入后立即計(jì)時(shí)，分別于2 min、10 min時(shí)從小鼠眼后靜脈叢取血0.02 mL，立即將血液加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，采用全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀在550 nm處測(cè)光密度值（OD ）。稱量小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝臟、胸腺及脾臟并稱重，按公式計(jì)算碳廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)α和免疫器官臟器指數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，組間比較采用單因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)正常小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的影響

人參總皂苷組和刨附片高劑量組小鼠的碳粒廓清指數(shù)K顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。此外，炮天雄高、中劑量組和刨附片中、低劑量組表現(xiàn)出增強(qiáng)小鼠吞噬功能的趨勢(shì)。

表1 炮天雄和刨附片對(duì)成年小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的影響±S,N=10)

表1 炮天雄和刨附片對(duì)成年小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的影響±S,N=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別劑量(g．kg-1)Kα空白組-0.0140±0.00894.55±0.59人參總皂苷組2.500.0318±0.0149*5.56±1.04炮天雄高劑量組5.000.0181±0.00914.70±0.83炮天雄中劑量組2.500.0140±0.00564.44±0.22炮天雄低劑量組1.250.0240±0.01214.90±1.47刨附片高劑量組5.000.0262±0.0226*5.10±0.38刨附片中劑量組2.500.0217±0.00965.08±0.56刨附片低劑量組1.250.0203±0.00714.88±0.55

3.2 對(duì)幼年小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響

人參總皂苷組和試驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。人參總皂苷組表現(xiàn)出肝指數(shù)大于空白對(duì)照組的趨勢(shì)（P＞0.05）；試驗(yàn)組中，炮天雄高、中、低劑量組和刨附片高、中、低劑量組肝指數(shù)均低于空白對(duì)照組，但無顯著性差異（P＞0.05）。人參總皂苷組和炮天雄中、低劑量組脾指數(shù)低于空白對(duì)照組，炮天雄高劑量組和刨附片高、中、低劑量組均高于空白對(duì)照組，均無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 炮天雄和刨附片對(duì)小鼠免疫器官的臟器指數(shù)的影響(±s,N=10)

表2 炮天雄和刨附片對(duì)小鼠免疫器官的臟器指數(shù)的影響(±s,N=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別劑量(g．kg-1)肝指數(shù)(mg．g-1)脾指數(shù)(mg．g-1)空白組-52.35±3.304.89±0.84人參總皂苷組2.5054.02±4.214.43±0.62炮天雄高劑量組5.0049.31±3.864.97±0.76炮天雄中劑量組2.5050.15±3.803.69±0.57炮天雄低劑量組1.2551.42±3.793.81±0.55刨附片高劑量組5.0049.41±4.825.53±0.81刨附片中劑量組2.5050.01±4.254.14±0.92刨附片低劑量組1.2550.53±4.083.80±0.58

3.3 對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響

3.3.1 對(duì)血細(xì)胞數(shù)的影響 模型組小鼠的白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)顯著低于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，炮天雄低劑量組、刨附片各劑量組具有升高白細(xì)胞數(shù)的趨勢(shì)；刨附片低劑量組具有降低血小板數(shù)的趨勢(shì)。

表3 炮天雄和刨附片對(duì)免疫低下小鼠血細(xì)胞數(shù)的影響(±S,N=10)

表3 炮天雄和刨附片對(duì)免疫低下小鼠血細(xì)胞數(shù)的影響(±S,N=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

RBC(1012/L)WBC(109/L)HGB(g/L)PLT(109/L)給藥第6天給藥第10天給藥第6天給藥第10天給藥第6天給藥第10天給藥第6天給藥第10天空白組-5.36±1.30**6.04±1.108.41±1.868.47±1.27119.89±25.37 127.33±18.98249.89±73.03**313.44±29.62**模型組-1.54±0.551.85±0.578.29±0.828.36±0.41126.60±11.69125.90±8.02355.20±94.80434.80±100.72氣血康口服液組2.501.66±0.541.67±0.708.53±0.578.07±0.96128.90±6.59120.90±13.18421.00±80.08421.90±82.35炮天雄高劑量組5.001.57±0.481.93±0.797.90±0.718.26±0.71122.00±14.85 121.89±13.13357.89±56.69405.00±99.42炮天雄中劑量組2.501.58±0.391.90±0.417.86±0.578.07±0.59121.70±9.70120.50±10.01439.33±84.40416.78±74.45炮天雄低劑量組1.251.46±0.482.11±0.947.97±0.837.78±1.04123.00±10.59 115.40±14.28402.80±90.00393.30±61.68刨附片高劑量組5.001.59±0.292.45±0.598.66±0.628.33±0.68126.88±7.60122.38±8.70374.75±67.60430.38±97.05刨附片中劑量組2.501.33±0.222.04±1.088.46±0.468.27±0.62126.50±5.79120.80±10.26418.10±84.07459.60±42.09刨附片低劑量組1.252.13±0.68*1.96±0.418.39±0.548.34±0.82128.10±9.57122.10±12.57384.80±93.12393.60±98.65組別劑量(g．kg-1)

3.3.2 對(duì)碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的影響 在本實(shí)驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺致免疫低下模型小鼠并未表現(xiàn)出碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α下降，與空白組比較無顯著性差異。給藥組與模型組比較無明顯差異。

表4 炮天雄和刨附片對(duì)免疫低下小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的影響(±S,N=10)

表4 炮天雄和刨附片對(duì)免疫低下小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的影響(±S,N=10)

組別劑量(g．kg-1)Kα空白組-0.0062±0.00333.41±0.70模型組-0.0083±0.00323.68±0.43

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3.3 對(duì)免疫低下小鼠肝、脾、胸腺臟器指數(shù)的影響 模型組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)顯著低于正常組（P＜0.05）。給藥組與模型組比較并未有顯著性差異，炮天雄與刨附片各劑量表現(xiàn)出升高免疫低下胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的趨勢(shì)；氣血康口服液組、刨附片中劑量組與模型組比較，能顯著升高肝臟指數(shù)（P＜0.05）。

表5 炮天雄和刨附片對(duì)免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響(±S,N=10)

表5 炮天雄和刨附片對(duì)免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響(±S,N=10)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

肝臟指數(shù)(mg．g-1)空白組-3.58±0.73**3.41±0.65**48.92±4.97模型組-1.19±0.341.80±0.1750.36±3.00氣血康口服液組2.501.39±0.502.03±0.6554.30±3.20*炮天雄高劑量組5.001.87±0.522.09±0.3450.33±3.38炮天雄中劑量組2.501.53±0.442.06±0.2149.66±3.41炮天雄低劑量組1.251.67±0.232.05±0.3550.58±2.66刨附片高劑量組5.001.46±0.572.15±0.5252.13±2.05刨附片中劑量組2.501.38±0.182.03±0.3154.46±2.58*刨附片低劑量組1.251.28±0.381.98±0.3449.81±3.39組別劑量(g．kg-1)胸腺指數(shù)(mg．g-1)脾指數(shù)(mg．g-1)

4 討論

附子為“回陽救逆第一品藥”，散寒作用可以理解為與增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、鎮(zhèn)痛、增加血氧等作用相關(guān)。隨著人們對(duì)附子的深入研究，發(fā)現(xiàn)附子及其不同炮制品能對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫均有不同程度的調(diào)節(jié)作用[7-14]。

單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一[15]。巨噬細(xì)胞的碳粒廓清指數(shù)K和校正吞噬指數(shù)α的大小可以反映內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬功能的強(qiáng)弱；當(dāng)細(xì)菌、病毒等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可迅速被單核巨噬系統(tǒng)吞噬和清除，吞噬速度越快則機(jī)體非特異性免疫功能越強(qiáng)大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刨附片5.0 g．kg-1在實(shí)驗(yàn)條件下表現(xiàn)出顯著性的提高小鼠碳粒廓清指數(shù)，與空白對(duì)照組比較這一差異具有顯著性（P＜0.05）。

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的抗腫瘤藥物之一，是一種細(xì)胞毒性藥物，可損傷機(jī)體的免疫器官，抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，可使脾臟指數(shù)降低[16]，使白細(xì)胞、血小板減少，貧血[17]。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下小鼠模型，結(jié)果顯示其白細(xì)胞和血紅蛋白減少，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低。本實(shí)驗(yàn)中，炮天雄組、刨附片對(duì)免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)有升高作用趨勢(shì)，刨附片中劑量組對(duì)免疫低下小鼠的肝臟指數(shù)有升高，提示炮天雄和刨附片具有一定增強(qiáng)免疫功能作用。此外，在前期研究中對(duì)二者開展了急性毒性研究，結(jié)果顯示，刨附片、炮天雄水煎液灌胃小鼠均無明顯急性毒性，最大給藥量分別為25.2、27.2 g．kg-1[18]。故而，炮天雄和刨附片可作為增強(qiáng)免疫保健品的潛在資源。

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（責(zé)任編輯：李蕓霞）

Immunoregulation effect of Pao Tianxiong and Bao Fupian in mice/

LI Meng-ting, HU Ting-ting, XIONG Qiu-yun, MIAO Lu-lin, XIE Xiao-fang, PENG Cheng// (School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan )

Objective:To observe the immunoregulatory effect of Pao tianxiong (PTX) and Bao Fupian (BFP).Method:The water decoction of PTX and BFP were prepared using standard extracts method. After grouping mice，different groups were given PTX or BFP in the doses of 5.0 g．kg-1, 2.5 g．kg-1, 1.25 g．kg-1for 30 days or 15days. Carbon clearance test and immune organ index were used to inspect the effect of PTX and BFP on non-speci fi c immunity on normal mice. Moreover, immunosuppression mice were gavaged in different doses of PTX and BFP for 11 days. The immunity indices such as macrophage phagocytosis,peripheral blood cell levels and immune organ indices were tested.Result:5.0 g．kg-1BFP can signi fi cantly increase the carbon clearance index K in normal mice (P＜0.05). PTX in the doses of 5.0, 2.5, 1.25 g．kg-1and BFP in the doses of 5.0, 2.5, 1.25 g．kg-1had a trend of increasing thymus index and spleen index in immunosuppression mice. 2.5 g．kg-1BFP signi fi cantly increased liver index in immunosuppression mice (P＜0.05).Conclusion:BFP and PTX have certain effect on strengthening the immune function both in normal mice and immunosuppression mice.

Pao tianxiong; Bao Fupian; immunoregulation; non-speci fi c immunity

R 285.5

A

1674-926X(2017)03-013-04

國(guó)家自然科學(xué)基金人才培養(yǎng)項(xiàng)目(NO:J1310034)：成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥基礎(chǔ)基地科研訓(xùn)練及科研能力提高項(xiàng)目（KY2015-001）。

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

李夢(mèng)婷(1993-)，女，中藥藥理學(xué)博士研究生在讀，研究方向中藥藥理與毒理研究

Email:cdutcmlmt@163.com.

彭 成，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c毒理研究工作 Email:pengchengchengdu@126.com.

2016-09-26