阿特拉津殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

吳 柳， 豆小文， 孔維軍， 楊世海， 楊美華*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),藥用植物研究所,北京 100193)

1 引言

阿特拉津又名莠去津，化學(xué)名稱為2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪，是三嗪類除草劑中最早使用的除草劑之一，遍布我國(guó)華北、東北等地區(qū)[1]。阿特拉津主要用于玉米、甘蔗、高梁等作物的苗前和苗后除草。由于該化合物的光解和水解速度緩慢并且使用量較大，使其持久性吸附于土壤，殘留于湖泊、河流、海洋生態(tài)環(huán)境中，其活性可保持?jǐn)?shù)年，極易造成環(huán)境污染，甚至危害人類健康[2]。研究表明該類化合物具有致癌、致畸、致基因突變毒性，并且對(duì)生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)都有影響。在環(huán)境檢測(cè)中我們往往會(huì)忽略阿特拉津降解產(chǎn)物，如羥基化阿特拉津(HYA)、脫乙基脫異丙基阿特拉津(DEDIA)、脫乙基阿特拉津(DEA)和脫異丙基阿特拉津(DIA)等[3]都與阿特拉津的毒性相當(dāng)。2015年6月1日，歐洲食品安全局經(jīng)過(guò)評(píng)估設(shè)定谷物中阿特拉津的最大殘留限量為0.1 mg/kg。近日,我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了“2016年農(nóng)藥專項(xiàng)整治行動(dòng)方案”，將重點(diǎn)對(duì)克百威、水胺硫磷、氧樂(lè)果、乙酰甲胺磷、2，4-D丁酯、莠去津等農(nóng)藥進(jìn)行監(jiān)測(cè)和再評(píng)價(jià),加強(qiáng)農(nóng)藥使用安全。因此，建立阿特拉津殘留的高靈敏度的定性定量檢測(cè)技術(shù)尤為重要。

目前，用于阿特拉津的檢測(cè)方法包括氣相色譜[4]、液相色譜[5]、氣相色譜-質(zhì)譜[6]、液相色譜-質(zhì)譜[7]、超高液相色譜[8]等。這些方法雖然準(zhǔn)確度高、靈敏度好，但儀器設(shè)備昂貴且操作繁瑣，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大批量的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。生物傳感器操作時(shí)間短、成本低、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單，近年迅速發(fā)展，在檢測(cè)阿特拉津方面成為一大熱點(diǎn)。隨著納米材料優(yōu)越性能的開(kāi)發(fā)和利用，納米材料不僅為傳感器構(gòu)建提供了良好的敏感材料，還為傳感技術(shù)的探索提供了新思路?，F(xiàn)代傳感器技術(shù)是一種集納米技術(shù)、生物技術(shù)和自組裝方法于一體的先進(jìn)檢測(cè)手段，為提高信號(hào)的靈敏度，縮短響應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)大線性范圍，優(yōu)化設(shè)備性能創(chuàng)造了條件[9]。本文系統(tǒng)綜述了酶抑制傳感器、免疫傳感器和分子印跡傳感器結(jié)合常見(jiàn)納米材料在檢測(cè)阿特拉津殘留方面的研究進(jìn)展，在為開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確可靠、便攜的生物傳感設(shè)備，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)阿特拉津提供思路和依據(jù)。

1 酶抑制傳感器

酶抑制傳感器是將生物酶作為敏感基元，目標(biāo)物質(zhì)通過(guò)抑制酶與底物的反應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制率，而抑制率與目標(biāo)物濃度成正相關(guān)，故通過(guò)計(jì)算抑制率可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量分析。構(gòu)建的傳感器件中敏感基元與目標(biāo)物之間的相互作用，是通過(guò)轉(zhuǎn)換器將電化學(xué)變化、熱變化、光效應(yīng)或直接電信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)的電信號(hào)，以達(dá)到檢測(cè)的目的[10]。農(nóng)殘檢測(cè)中酶抑制傳感器主要用生物酶，包括乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶和酪氨酸酶。其中，乙酰膽堿酯酶是使用最早且常用的生物酶，與農(nóng)藥相互作用產(chǎn)生不可逆抑制，因此構(gòu)建的酶?jìng)鞲衅鞒３o(wú)法重復(fù)使用，通常用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)。酪氨酸酶完全克服了上述缺陷，制備的生物傳感器重復(fù)性好且靈敏度高，所以酪氨酸酶生物傳感器是檢測(cè)中最具優(yōu)勢(shì)的酶抑制傳感器，并且已經(jīng)結(jié)合納米材料用于阿特拉津的檢測(cè)。

通過(guò)不同的制備方法和利用納米技術(shù)修飾電極可提高酶抑制傳感器的靈敏度。其中碳納米管具有特殊的物理化學(xué)性能和電性能，高的比表面積，能增強(qiáng)電子轉(zhuǎn)移的性質(zhì)和高導(dǎo)熱性，同時(shí)能夠固定酶和保持酶的活力，近年來(lái)備受關(guān)注。韓恩等[11]利用阿特拉津農(nóng)藥對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，將酪氨酸固定在聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)功能化的碳納米管的玻碳電極表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿特拉津農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。PDDA功能化的碳納米管能夠增大電極表面酪氨酸酶的包埋量，并有利于提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。在優(yōu)化條件下，該電化學(xué)生物傳感器對(duì)阿特拉津檢測(cè)范圍為0.01～0.8 μg/mL，檢測(cè)限4 ng/mL。Tortolini等[12]利用優(yōu)化生物傳感器的絲網(wǎng)印刷電極，用不同的方法固定酪氨酸酶(物理、化學(xué))，以鄰苯二酚為底物，通過(guò)阿特拉津抑制酶的活性間接對(duì)其定量。實(shí)驗(yàn)證明苯乙烯基吡啶作為交聯(lián)劑的碳納米管絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)效果最佳，檢測(cè)限可達(dá)0.3 mg/L，線性范圍為0.5～20 mg/L，回收率高達(dá)95%。

2 免疫傳感器

免疫傳感器是將抗體或抗原作為特定的感測(cè)元件，并提供濃度依賴信號(hào)的生物傳感器。它們包括兩個(gè)過(guò)程，分子識(shí)別處理和信號(hào)傳輸過(guò)程。分子識(shí)別處理用于檢測(cè)特定抗原-抗體在載體表面結(jié)合的反應(yīng)，而信號(hào)傳輸是利用特異性結(jié)合引起受體變化，從而產(chǎn)生電化學(xué)、光學(xué)、光譜學(xué)或電參數(shù)的變化的過(guò)程[13]。依據(jù)免疫傳感器的基本原理，用于檢測(cè)阿特拉津的方法可以分為三類：免疫層析法、電化學(xué)免疫傳感器、表面等離子共振免疫傳感器。

2.1 免疫層析法

免疫層析法是20世紀(jì)90年代興起的一種快速檢測(cè)技術(shù)。該方法的靈敏度可達(dá)到痕量甚至超痕量水平，具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。依據(jù)識(shí)別元素的不同，發(fā)展了兩種快速檢測(cè)技術(shù)，即膠體金免疫層析技術(shù)和核酸適配體層析技術(shù)。我們課題組正進(jìn)行膠體金試紙條和核酸適配體試紙條的相關(guān)研究[14 - 15]。

膠體金免疫層析試紙條是繼熒光素、放射同位素、酶標(biāo)記后發(fā)展起來(lái)的第四大標(biāo)記技術(shù)，也是目前最常見(jiàn)的用于檢測(cè)阿特拉津的免疫層析法。Kaur等[16]開(kāi)發(fā)了一種新的半抗原-蛋白-金顆粒偶聯(lián)物，此偶聯(lián)物性質(zhì)穩(wěn)定，在低溫條件下儲(chǔ)存8周都未見(jiàn)失活。并以牛血清蛋白為載體蛋白，將賴氨酸殘基連接阿特拉津半抗原，并由半胱氨酸殘基連接膠體金顆粒構(gòu)造側(cè)流式免疫檢測(cè)試紙條。此方法提高了檢測(cè)靈敏度，可在5 min內(nèi)檢測(cè)水樣中1.0 μg/L的阿特拉津含量。

核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配基技術(shù)從體外篩選出來(lái)的單鏈寡聚核苷酸序列，核酸適配體對(duì)靶物質(zhì)的識(shí)別力高、親和力強(qiáng)，適配體與靶物質(zhì)的解離常數(shù)一般是nmoL/mL，有的甚至達(dá)到pmoL/mL，因此核酸適配體被人們比喻為“化學(xué)抗體”[17]。核酸適配體比抗體穩(wěn)定，有替代抗體的趨勢(shì)，目前對(duì)核酸適配體試紙條處于探索階段，雖然并沒(méi)有應(yīng)用于阿特拉津的檢測(cè)，但對(duì)阿特拉津的核酸適配體的篩選研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[18]，這為基于適配體的阿特拉津快速檢測(cè)技術(shù)提供了一個(gè)新的發(fā)展方向。

2.2 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器是利用抗體-抗原相互作用影響電極或緩沖液的電性，通過(guò)測(cè)量由免疫反應(yīng)而引起的電勢(shì)、電流、電導(dǎo)或阻抗變化來(lái)確定目標(biāo)物的含量[19]。電化學(xué)免疫傳感器可以對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量或半定量分析。目前在電化學(xué)免疫傳感器研究領(lǐng)域內(nèi)，常將納米技術(shù)、免疫技術(shù)和自組裝方法集于一體，用于檢測(cè)阿特拉津的殘留。納米材料由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)，如可以改善傳感器的識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)程，部件微型化可以提高信噪比等，對(duì)創(chuàng)建新型生物傳感器非常適用[20]。加入納米材料后能明顯提高生物傳感器的靈敏度、減少響應(yīng)時(shí)間。在檢測(cè)阿特拉津的電化學(xué)免疫傳感器上使用的納米材料有納米顆粒(納米金、納米銀)、金屬氧化物(TiO2)、碳材料(碳棒、石墨烯)、磁球、聚合物(聚吡咯)等，見(jiàn)表1。

2.2.1基于納米金的電化學(xué)免疫傳感器納米金性質(zhì)穩(wěn)定、表面積體積比高，提高了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，放大了檢測(cè)物的信號(hào)。Liu等[21]將納米金固定在金電極表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)阿特拉津的無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)。整個(gè)免疫傳感器的制造工藝特點(diǎn)分別是循環(huán)伏安法、電化學(xué)阻抗譜，并使用鐵氰化物作為電化學(xué)氧化還原指示劑?；诎⑻乩騿慰寺】贵w和阿特拉津之間的相互作用，經(jīng)由微分脈沖伏安法產(chǎn)生電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。Pichetsurnthorn等[22]提出了一種新的納米多孔便攜式生物傳感裝置，可以通過(guò)無(wú)標(biāo)記檢測(cè)法識(shí)別痕量污染物阿特拉津。此種傳感器包括一個(gè)多孔氧化鋁膜一體化的印刷電路板，通過(guò)利用固定阿特拉津的小分子，設(shè)計(jì)了電化學(xué)阻抗譜生物傳感器，可檢測(cè)微量的阿特拉津。Giannetto等[23]發(fā)展了一個(gè)新的用于檢測(cè)阿特拉津的免疫傳感器，通過(guò)電沉積法將100 nm的納米金固定在碳納米電極上，隨后功能化金納米材料，利用2-氨基乙硫醇自組裝單層膜法將樹(shù)枝狀聚合物固定到金納米材料上。樹(shù)枝狀分子通過(guò)共價(jià)鍵與阿特拉津牛血清白蛋白(ATR-BSA)之間的綴合物結(jié)合。基于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍在10-2～102ng/mL之間，檢測(cè)限和定量限分別為1.2 ng/L和5 ng/mL。

2.2.2基于磁性微球的電化學(xué)免疫傳感器磁性微球是將磁性粒子分散、包裹于高分子材料中，或者包被在高分子材料表面形成的具有特殊功能團(tuán)的復(fù)合微球。其表面具有生物活性的官能團(tuán)，有研究者利用磁性微球比表面積大，易分離，表面可修飾活性官能團(tuán)(如-OH、-COOH、-NH2)等優(yōu)點(diǎn)將其用于免疫測(cè)定[24]。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)。Zacco等[25]設(shè)計(jì)了新型電化學(xué)免疫傳感器，將抗體偶聯(lián)在磁球上，并用阿特拉津和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物與阿特拉津競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，檢測(cè)食物和環(huán)境中阿特拉津殘留。結(jié)果表明此方法非常靈敏、便宜、簡(jiǎn)單且容易操作。

2.3 表面等離子共振免疫傳感器

表面等離子共振(SPR)免疫傳感器屬于非標(biāo)記型免疫傳感器，同時(shí)也屬于免疫芯片的一種，將抗體作為識(shí)別元件、光敏器件作為換能器，具有前處理簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、檢測(cè)時(shí)間短、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型檢測(cè)技術(shù)。Farré等[40]用SPR免疫傳感器檢測(cè)水樣中阿特拉津的殘留，這種免疫測(cè)定基于抑制形式并與純化的多克隆抗體結(jié)合，與分析物衍生物共價(jià)固定在一個(gè)金傳感器表面，將烷硫醇包被在傳感器的表面以方便重復(fù)利用，最終檢測(cè)限可達(dá)20 ng/mL。并通過(guò)固相萃取-氣相/質(zhì)譜聯(lián)用的方法(SPE-GC/MS)驗(yàn)證新免疫測(cè)定方法的可行性。柳明等[41]對(duì)水樣中阿特拉津進(jìn)行檢測(cè)，利用巰基十一酸在SPR芯片表面形成自組裝膜衍生出羧基，再經(jīng)NHS/DCC 活化法，通過(guò)酰胺鍵將阿特拉津完全抗原(AT-OVA) 固定在芯片表面，該方法固定效率高、牢固穩(wěn)定、對(duì)抗原抗體結(jié)合影響小，有利于保證檢測(cè)方法的靈敏度和重復(fù)性。該方法的檢測(cè)限低至2.34 ng/mL，Ic50可達(dá)32.36 ng/mL，檢測(cè)范圍在5.75～181.97 ng/mL之間，整個(gè)分析時(shí)間小于30 min。為了提高檢測(cè)的靈敏度，會(huì)在SPR傳感器的表面包裹一層包括金納米粒子、銀納米粒子、磁性納米粒子等增強(qiáng)信號(hào)的納米材料。Liu等[42]將金納米粒子組裝到芯片表面作為傳感層以增強(qiáng)SPR信號(hào)，然后將阿特拉津單克隆抗體固定在金納米粒子表面上。通過(guò)考察三種不同直徑的金納米顆粒對(duì)增強(qiáng)SPR免疫傳感器的檢測(cè)信號(hào)影響。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，直徑為30.35 nm金納米粒子對(duì)阿特拉津(即三種金納米粒子中直徑最大的)的檢測(cè)最靈敏，檢測(cè)限可達(dá)1.0 ng/mL，檢測(cè)范圍為1.0～15.6 ng/mL。Tmoassetti等[43]對(duì)比研究了SPR免疫傳感器、傳統(tǒng)免疫傳感器和絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器三種檢測(cè)方法，對(duì)6批牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，都獲得了令人滿意的結(jié)果。

3 分子印跡傳感器

分子印跡技術(shù)(MIT)又稱分子烙印技術(shù)，其核心是分子印跡聚合物(MIPs),其被大多數(shù)研究者們形象的稱之為“塑料抗體”[44]，通過(guò)MIPs的特異性識(shí)別位點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)從非生物活體獲得“抗體”。當(dāng)模板分子與功能單體通過(guò)以共價(jià)鍵，非共價(jià)鍵或半共價(jià)鍵的方式相結(jié)合，接觸時(shí)會(huì)形成多重作用位點(diǎn)，通過(guò)交聯(lián)劑將模板分子和功能單體形成高度的三維交聯(lián)網(wǎng)狀聚合物，固化功能單體。當(dāng)模板分子去掉后，聚合物就會(huì)形成與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，可對(duì)目標(biāo)分子有選擇性的識(shí)別(圖1)。

圖1 分子印跡過(guò)程示意圖Fig.1 Diagram of molecular imprinting process

分子印跡聚合物具有耐高溫、耐壓、耐酸堿的特點(diǎn)[45]。分子印跡聚合物作為一種合成受體，可以作為傳感器的識(shí)別元件，分子印跡傳感器對(duì)目標(biāo)分子高度專一識(shí)別性，此外其在機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性方面也不遜色于化學(xué)傳感器[46]。Shoji等[47]利用電化學(xué)還原反應(yīng)將阿特拉津的分子印跡聚合物作為膜固定在金電極表面，并和未固定聚合物的金電極進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)分子印跡聚合物是識(shí)別元素，是有效的電化學(xué)傳感器。該實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、便宜，適用于各種分子的檢測(cè)。Pardieu等[48]基于分子印跡導(dǎo)電性聚合物(MICP)的電化學(xué)傳感器被開(kāi)發(fā)，可以識(shí)別靶分子阿特拉津。共聚物利用分子間的氫鍵固定靶分子，獲得共聚物后除掉阿特拉津，所獲得的模板對(duì)目標(biāo)分子阿特拉津有很高的特異性，通過(guò)MICP循環(huán)伏安的變化則能達(dá)到定量分析的目的，該法可準(zhǔn)確測(cè)定10×10-9～1.5×10-3mol/L濃度范圍的阿特拉津。陳凱尹等[49]以阿特拉津?yàn)槟０?，采用沉淀聚合法制備了粒徑約為210 nm的阿特拉津納米分子印跡聚合物微球，通過(guò)紫外分光光度法確定模板分子與功能單體的最佳物質(zhì)的量的比為1∶4，結(jié)果表明分子印跡聚合物納米微球存在兩種不同結(jié)合位點(diǎn)，此方法制備的分子印跡聚合物對(duì)阿特拉津具有良好的選擇性吸附能力。

然而，傳統(tǒng)的分子印跡技術(shù)還存在一些不足，如結(jié)合能力低、選擇性差、不能完全除去模板。為了解決這些難題，研究學(xué)者利用磁性納米粒子(MNPs)制備了核殼結(jié)構(gòu)磁性納米分子印跡聚合物，其中殼層包含催化活性物質(zhì)，使活性位點(diǎn)充分暴露于粒子表面，而MNPs作為核心，在外磁場(chǎng)作用下則能實(shí)現(xiàn)快速回收和分離的效果。因此，磁性納米分子印跡技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。在MNPs表面合成分子印跡聚合物(MIP)殼層，得到磁性分子印跡聚合物(MMIPs)，一方面MMIP 能夠選擇性識(shí)別目標(biāo)分子，另一方面能夠在磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)快速與模板分離[50]。Men等[51]利用Fe3O4@SiO2復(fù)合微球經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑(KH570)修飾，該法采用分子印記技術(shù)，分別以阿特拉津、甲基丙烯酸和乙二醇二甲基作為模板分子、功能單體和交聯(lián)劑，制備了核殼型磁性分子印跡聚合物，并利用紫外光譜和掃描電鏡對(duì)材料進(jìn)行表征，該磁性分子印跡方法可實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中阿特拉津殘留的檢測(cè)。Zhao等[52]利用單孔空心分子印跡微球(h-MIMs)制備了硬模板的方法用于樣品的分析，微球表現(xiàn)出更大的比表面積，中空結(jié)構(gòu)和該外殼的孔使它比沉淀聚合分子印跡和表面聚合分子印跡的方法的結(jié)合容量更高，吸附速率比更快,其主要特點(diǎn)在于中空的h-MIMs的結(jié)構(gòu)，多個(gè)結(jié)合腔分別位于該h-MIMs的內(nèi)表面和外表面，這有利于從聚合物中除去模板分子，使目標(biāo)分子與聚合物的重新綁定。并且此方法的基質(zhì)效應(yīng)比液質(zhì)(HPLC-MS/MS)分析的常規(guī)固相萃取方法低，通過(guò)該方法測(cè)得阿特拉津在兩種大米和一種小麥中的殘留情況分別是5.1 ng/g、6.7 ng/g和5.6 ng/g。

4 展望

阿特拉津的快速檢測(cè)技術(shù)作為常規(guī)檢測(cè)分析技術(shù)的有力補(bǔ)充工具，為現(xiàn)場(chǎng)篩查滿足高通量分析要求提供了可能，涉及檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域也在逐步拓寬。我國(guó)阿特拉津的快速檢測(cè)技術(shù)正處于初步階段，雖然國(guó)內(nèi)有很多銷售阿特拉津的快速檢測(cè)產(chǎn)品的公司，但大多是以代理國(guó)外公司的產(chǎn)品為主。目前阿特拉津的檢測(cè)產(chǎn)品主要有Abraxis公司的阿特拉津試紙條；Modern water公司的阿特拉津試紙條檢測(cè)儀。對(duì)于其他種類的快速檢測(cè)技術(shù)，由于生物活性物質(zhì)不穩(wěn)定、重現(xiàn)性低等因素，使其無(wú)法產(chǎn)業(yè)化。雖然快速檢測(cè)技術(shù)不夠完善，但市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力巨大，為研究者開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)技術(shù)提供參考。隨著對(duì)當(dāng)前先進(jìn)技術(shù)的不斷改進(jìn)，相信未來(lái)這一技術(shù)必將會(huì)成為評(píng)價(jià)食品安全及環(huán)境檢測(cè)的一種重要手段。