黃烷酮對映體的高效液相色譜手性拆分及含量測定

陳 程， 袁倩姝， 張靜雨， 李曉旋， 王 勇

(天津大學(xué)理學(xué)院，天津 300350)

手性分子存在于所有生命體中，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖等具有手性的分子構(gòu)成了生命體本身[1]。手性分子在醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥等眾多行業(yè)中也扮演著重要的角色。大多數(shù)藥物分子具有手性中心，其兩個對映體在生命體中往往表現(xiàn)出不同的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性，典型的例子是沙利度胺[2]。在食品工業(yè)中，大量的添加劑、調(diào)味劑、防腐劑，包括許多有機(jī)食品，都是手性化合物。農(nóng)用化學(xué)品中的對映體對植物生長有影響，并且可能進(jìn)一步對環(huán)境產(chǎn)生副作用，甚至對人體健康產(chǎn)生毒性影響[3]。因此，利用手性拆分獲取對映體中的光學(xué)純部分具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

黃烷酮(Flavanone)及其衍生物大量存在于天然產(chǎn)物中，并且表現(xiàn)出諸多生物活性，如殺菌、抗炎、抗腫瘤、抗誘變、抗氧化、抗HIV病毒、抗心血管疾病、抗惡性細(xì)胞增生作用等[4]，它是一類研究價值很高的化合物。黃烷酮母體上共有10個可被取代的位置，具備極大的結(jié)構(gòu)修飾潛力[5]，而且黃烷酮是合成多種類黃酮類化合物的中間體。因此，獲取光學(xué)純黃烷酮對映體化合物具有十分重要的意義。

環(huán)糊精在制藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品、衛(wèi)生、紡織、環(huán)境、催化、生物技術(shù)及色譜等幾乎所有的工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[6]。環(huán)糊精分子具有略呈錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部疏水而外部親水[7]，同時具有多個手性中心，具有手性識別功能，特別是衍生化的β-環(huán)糊精鍵合固定相，對手性化合物具有良好的拆分能力，因此被大量應(yīng)用于高效液相色譜法的手性拆分[8]。本實(shí)驗選取環(huán)糊精手性色譜柱，利用高效液相色譜測定樣品中R-及S-黃烷酮構(gòu)型的含量，優(yōu)化分離條件并確定旋光純構(gòu)型的保留順序。目前，高效液相色譜法已廣泛應(yīng)用于手性化合物的拆分。但對于黃烷酮對映體的構(gòu)型保留順序的確定及對其在環(huán)糊精固定相手性分離的全面優(yōu)化研究還未見報道。本研究為該類化合物的拆分提供方法參考。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-16高效液相色譜儀(日本，島津公司)。

R-黃烷酮(純度98%，天津希恩斯奧普德科技有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純)；待測黃烷酮樣品，用高純水溶解樣品，樣品濃度為0.5 mg/mL。實(shí)驗用水為高純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：CD-CSP2手性柱；流動相：乙腈(ACN)-水、甲醇(MeOH)-水；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。流動相使用前用濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相中有機(jī)溶劑種類對分離效果的影響

流動相中有機(jī)溶劑種類對R、S-黃烷酮拆分效果有較大影響。實(shí)驗分別以乙腈-水和甲醇-水為流動相(體積比均為50∶50)，在流速為1.00 mL/min、柱溫為30 ℃的條件下，研究色譜柱在不同有機(jī)溶劑種類條件下手性拆分的性能。相關(guān)的色譜分離結(jié)果見圖1。由圖1可知，以甲醇-水為流動相時有機(jī)溶劑出峰較慢，分離度較差，而以乙腈-水為流動相時有機(jī)溶劑出峰較快，分離效果較好。這是由于反相高效液相色譜是以強(qiáng)疏水性的填料為固定相，流動相的極性越小洗脫能力越強(qiáng)。乙腈的極性比甲醇小，且乙腈是極性非質(zhì)子性溶劑，故它的洗脫能力要比甲醇強(qiáng)。因此，使用乙腈-水為流動相進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

2.2 流動相比例對分離效果的影響

流動相比例對R、S-黃烷酮拆分效果有較大影響。以乙腈-水為流動相，在流速為1.00 mL/min、柱溫為30 ℃的條件下，考慮保留因子、選擇性及分離度隨流動相比例的變化，從而研究色譜柱在不同流動相比例條件下手性拆分性能。選擇乙腈-水體積比30∶70至70∶30進(jìn)行實(shí)驗，不同比例下的色譜分離情況見圖2，相關(guān)的色譜分離參數(shù)見表1。由表1可知，隨流動相中乙腈的比例增加，保留因子、選擇性及分離度不斷減小。在流動相為乙腈-水=30∶70(體積比)的條件下，黃烷酮手性拆分效果最好。可能是隨著流動相中乙腈比例的增加，乙腈占據(jù)了環(huán)糊精的空腔，降低了環(huán)糊精的手性拆分作用力，使得黃烷酮樣品的保留時間減少，拆分效果降低。因此，使用體積比為30∶70的乙腈-水為流動相進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

圖1 流動相中有機(jī)溶劑種類對分離效果的影響Fig.1 The effect of species of mobile phase on the enantiomeric separation

圖2 流動相比例對分離效果的影響Fig.2 The effect of composition of mobile phase on the enantiomeric separation 表1 流動相比例對分離效果的影響Table 1 The effect of composition of mobile phase on the enantiomeric separation

Composition of mobile phaseCapacity factork1k2Separation factor(α)Resolution(RS)30%1.732.581.522.9540%0.500.661.471.8650%0.440.581.320.9660%0.220.241.11<0.370%--10

2.3 流速對分離效果的影響

根據(jù)色譜動力學(xué)理論范氏方程可知，流速對色譜拆分行為會產(chǎn)生重要的影響。本實(shí)驗研究不同流速下β-環(huán)糊精對黃烷酮手性拆分效果的影響，數(shù)據(jù)列于表2，不同流速下的色譜分離情況見圖3。由表2可知，隨著流速的增加保留時間縮短，選擇性不變，分離度呈RS逐漸減小的趨勢。這是由于隨著流速的增加，導(dǎo)致溶質(zhì)洗脫速度加快，但同時傳質(zhì)阻力項影響增大，導(dǎo)致保留因子變化波動。因此，在手性拆分中選擇一個適宜的流速十分重要。由于流速為1.0 mL/min時，在較短的時間內(nèi)獲得較高的分離度，后續(xù)實(shí)驗將固定流速為1.0 mL/min。

表2 流速對拆分行為的影響Table 2 The effect of flow rate on the enantiomeric separation

2.4 溫度對分離效果的影響

在乙腈-水(30∶70，V/V)為流動相，流速為1.0 mL/min的條件下，測定不同溫度對黃烷酮拆分效果的影響。因受室溫限制，選擇溫度范圍30 ℃至45 ℃進(jìn)行探究。不同溫度下的色譜分離情況見圖4，數(shù)據(jù)列于表3。由表3可見，隨著溫度的升高，選擇性、保留因子和分離度均有所下降。溫度升高提高了溶質(zhì)擴(kuò)散，削弱了環(huán)糊精空腔及其他作用位點(diǎn)與樣品之間的相互作用，導(dǎo)致樣品被快速洗脫。因此，在一定范圍內(nèi)溫度越低越有利于樣品分離，選擇30 ℃為最佳溫度。由2.1、2.2和2.3的優(yōu)化結(jié)果可知，黃烷酮在環(huán)糊精手性色譜柱上最佳分離條件為：流動相為乙腈-水(30∶70，V/V)、流速為1.0 mL/min、溫度為30 ℃。

圖3 流速對拆分行為的影響Fig.3 The effect of flow rate on the enantiomeric separation

圖4 溫度對拆分行為的影響Fig.4 The effect of column temperature on the enantiomeric separation 表3 溫度對拆分行為的影響Table 3 The effect of column temperature on the enantiomeric separation

Column temperature(℃)Capacity factork1k2Separation factor(α)Resolution(RS)301.782.771.552.98351.542.271.472.51401.291.811.402.03451.101.481.341.64

圖5 R-型黃烷酮和外消旋黃烷酮色譜圖Fig.5 Charomatogram of R-flavanone and racemic flavanone

2.5 R、S-黃烷酮定性分析

在流動相為乙腈-水(30∶70，V/V)、流速為1.0 mL/min、溫度為30 ℃的條件下，分別測得R-黃烷酮和外消旋黃烷酮的色譜圖，如圖5。根據(jù)保留時間可得到，外消旋黃烷酮的色譜圖中，前者為R-黃烷酮峰，后者為S-黃烷酮峰。

2.6 R、S-黃烷酮定量分析

在流動相為乙腈-水(30∶70，V/V)、流速為1.0 mL/min、溫度為30 ℃的條件下，分別求出樣品中所有組分的峰面積Ai和相對校正因子fi，然后依次求出各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wi，使用歸一化法進(jìn)行定量分析,經(jīng)計算可知黃烷酮樣品中，R-黃烷酮含量為53.94%，S-黃烷酮含量為46.06%。

3 結(jié)論

高效液相色譜手性拆分黃烷酮對映體，并對其進(jìn)行定性、定量分析，綜合考慮分析時間和分離效果，確定黃烷酮對映體的最佳分離條件為流動相為：乙腈∶水=30∶70(體積比)、流速為1.0 mL/min、溫度30 ℃。R-黃烷酮與固定相的作用弱于S-黃烷酮，在色譜柱中首先被洗脫。以面積歸一化法計算，可知黃烷酮樣品中R-黃烷酮含量為53.94%，S-黃烷酮含量為46.06%。