多重?zé)晒釲AMP法在食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測中的應(yīng)用

田 浩李光耀 史笑娜

（河北東淼檢測科技股份有限公司科研企劃部，河北保定 071000）

·應(yīng)用研究·

多重?zé)晒釲AMP法在食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測中的應(yīng)用

田 浩*李光耀 史笑娜

（河北東淼檢測科技股份有限公司科研企劃部，河北保定 071000）

為解決食源性致病菌傳統(tǒng)檢測方法耗時(shí)長、工作量大問題，利用金黃色葡萄球菌femA序列和沙門氏菌invA序列設(shè)計(jì)了兩套LAMP引物，添加熒光染料建立混合體系，通過恒溫?zé)晒鈾z測儀對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到相關(guān)曲線，同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，并且對(duì)100批次食品樣品進(jìn)行了效果驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測方法的普篩性與特異性良好，靈敏度達(dá)到71 CFU/mL，檢測過程不易污染、耗時(shí)短。該方法可應(yīng)用于部分食源性致病菌的快速初篩。

多重?zé)晒釲AMP法；致病菌；食品檢測；快速檢測

食源性致病菌指食品中能夠引起人或動(dòng)物疾病的致病性微生物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年由食品中致病菌引起的食源性疾病報(bào)告病例數(shù)約占全部報(bào)告的40%～50%。

沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)檢測方法均為增菌分離后生化鑒定，檢測時(shí)間分別為4～8天和3～5天，并且每種致病菌需應(yīng)用獨(dú)立的檢測方法單獨(dú)進(jìn)行檢測，工作量大，檢測周期長，且受到檢測人員的專業(yè)、經(jīng)驗(yàn)等多種因素限制，容易出現(xiàn)誤判。目前食品安全問題日趨嚴(yán)重，食源性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測與預(yù)警工作需要更加高效、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

LAMP法即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification） 是 Notomi等于 2000年開發(fā)的一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60℃～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，15 min～60 min左右即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增。LAMP體系中加入熒光標(biāo)記物（SYBR GREEN I核酸染液） 后可以通過熒光檢測儀檢測熒光信號(hào)，根據(jù)反應(yīng)曲線判斷反應(yīng)體系中有無特異擴(kuò)增。

目前的LAMP法主要為一個(gè)體系檢測一種目標(biāo)菌。因?yàn)槲覈氖吃葱灾虏【L(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作種類多、范圍大、時(shí)間緊，所以實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)菌的同體系初篩就顯得尤為重要。因此，本研究針對(duì)檢測頻率最高的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌建立了一種多重?zé)晒釲AMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

本試驗(yàn)參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》中附錄D，采用食源常見標(biāo)準(zhǔn)菌株12株（均自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買）：金黃色葡萄球菌ATCC25923，腸炎沙門氏菌CICC21482，阪崎腸桿菌CICC21560，表皮葡萄球菌CMCC（B）26069，銅綠假單胞菌 ATCC27853，致病性大腸埃希氏菌CICC10372，福氏志賀氏菌CMCC（B）51572，奇異變形桿菌 CMCC（B）49005，單增李斯特氏菌ATCC19115，乙型溶血性鏈球菌CICC10373，大腸桿菌ATCC25922，大腸桿菌O157 ATCC43889。

本研究均采用上述三代生長期標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.2 試驗(yàn)樣品

50批次肉制品樣品，保定翟老頭食品有限責(zé)任公司提供；50批次豆制品樣品，保定恒豆源食品有限公司提供。

1.3 材料與設(shè)備

Bst DNA聚合酶大片段、10×ThermoPol Buffer、SYBR GREENI染料，引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

3MPetrifilm致病菌測試紙，環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，廣州迪澳生物科技有限公司；ZHSY-50S震蕩培養(yǎng)箱，三洋電機(jī)(中國)有限公司；LGJ-12金屬恒溫浴，廣州迪澳生物科技有限公司；移液器，芬蘭艾斯瑪特儀器設(shè)備有限公司；Hitachi*CR-GIII離心機(jī)，株式會(huì)社日立制作所；TT-HES-1電泳儀，Hercuvan生物科技有限公司；810自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，上海山富科學(xué)儀器有限公司；BHC1300IIA/B2生物安全柜，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Deaou-308C恒溫?zé)晒鈾z測系統(tǒng)，廣州迪澳生物科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 模板DNA的制備

按照DNA抽提試劑盒使用說明對(duì)1.1中12種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行DNA提取，制得模板DNA上清液。

1.4.2 LAMP引物的制備

選擇金黃色葡萄球菌femA基因和沙門氏菌invA基因?yàn)榘谢颉＠迷诰€引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 4，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)LAMP引物。引物通過NCBI（Blast）進(jìn)行序列特異性的比對(duì)后進(jìn)行引物PCR試驗(yàn)驗(yàn)證，以規(guī)避引物間的相互干擾，最終確定的引物序列見表1。

表1 LAMP引物序列

1.4.3 多重?zé)晒釲AMP法反應(yīng)體系

25 μL反應(yīng)體系組成：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL， 10 μmol/L 外 引 物 1 （F3） 0.5 μL×2，10 μmol/L 外引物 2 （B3） 0.5 μL×2，10 μmol/L內(nèi)引物 1（FIP） 1.0 μL×2，10 μmol/L 內(nèi)引物 2（BIP） 1.0 μL×2，10 mmol/L dNTPs 4 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，150 mmol/L MgSO4 0.5 μL，8 U/μL Bst DNA 聚合酶大片段 1 μL，SYBR GREEN I染料 0.5 μL，模板 DNA 2.0 μL，補(bǔ)水 6.5 μL。

恒溫?zé)晒鈾z測系統(tǒng)條件：溫度61℃，時(shí)間30 min。

1.4.4 普篩性分析

以金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌以及兩者1:1混合菌株為目標(biāo)菌進(jìn)行熒光LAMP雙重檢測，觀察恒溫?zé)晒鈾z測儀數(shù)據(jù)曲線。應(yīng)用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測LAMP擴(kuò)增結(jié)果，分析多重檢測時(shí)的普篩性。

1.4.5 特異性分析

應(yīng)用本試驗(yàn)體系，以1.1中的非目標(biāo)菌株為對(duì)照菌株進(jìn)行熒光LAMP檢測，通過試驗(yàn)曲線和電泳圖分析特異性。

1.4.6 靈敏度分析

將1.4.4中使用的混合目標(biāo)菌株用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，得10-1、10-2、10-3、10-4菌株稀釋液后進(jìn)行LAMP檢測，得擴(kuò)增曲線。使用致病菌測試紙片對(duì)菌株稀釋液進(jìn)行定量檢測，以驗(yàn)證靈敏度。

1.4.7 人工污染樣品檢測

將100批次檢驗(yàn)樣品隨機(jī)人工污染10批次，然后對(duì)100批次樣品進(jìn)行致病菌初篩，以分析本方法在實(shí)際食品檢測工作中的應(yīng)用情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 普篩性試驗(yàn)

目標(biāo)菌株的熒光檢測曲線見圖1。

圖1 多重?zé)晒釲AMP法的普篩性

由圖1可知，目標(biāo)菌株擴(kuò)增曲線均呈指數(shù)增長，表明目標(biāo)菌株實(shí)現(xiàn)了良好擴(kuò)增。對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，電泳結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，目標(biāo)菌株均得明亮條帶，且條帶位置正常及清晰。由擴(kuò)增結(jié)果可知，熒光檢測儀器顯示結(jié)果與傳統(tǒng)電泳結(jié)果顯示一致，存在兩套特異性LAMP引物的多重LAMP反應(yīng)體系能夠?qū)旌夏繕?biāo)菌株及單獨(dú)目標(biāo)菌株實(shí)現(xiàn)普篩。

圖2 多重?zé)晒釲AMP法擴(kuò)增電泳圖（陽性）

2.2 特異性試驗(yàn)

由非目標(biāo)菌株的熒光檢測曲線（圖略）分析可知，非目標(biāo)菌株擴(kuò)增曲線均未呈指數(shù)增長，表明非目標(biāo)菌株未擴(kuò)增。對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，電泳結(jié)果見圖3。

圖3 多重?zé)晒釲AMP法擴(kuò)增電泳圖（陰性）

結(jié)果顯示，非目標(biāo)菌株無明亮條帶。對(duì)比圖1、圖2，說明本試驗(yàn)方法能夠?qū)δ繕?biāo)菌株實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增。

2.3 靈敏度分析

梯度混合目標(biāo)菌株的擴(kuò)增曲線見下頁圖4。

由圖4可知，10-1～10-5稀釋度的目標(biāo)菌株在本試驗(yàn)體系下的擴(kuò)增曲線均呈指數(shù)增長，表明均實(shí)現(xiàn)了良好擴(kuò)增。經(jīng)測試片檢測可得10-5稀釋度的金黃色葡萄球菌ATCC25923+沙門氏菌CICC21482混合菌懸液的濃度為71 CFU/mL，而熒光PCR方法的檢測靈敏度約為103CFU/mL。由此可知，本方法較一些傳統(tǒng)方法靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)菌株更大數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增。

圖4 多重?zé)晒釲AMP法的靈敏度

2.4 人工污染樣品實(shí)際應(yīng)用

對(duì)100批次檢驗(yàn)樣品FX-001～FX-100進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)初篩，并參照食品檢測國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4《沙門氏菌檢驗(yàn)》和GB 4789.10《金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，與傳統(tǒng)檢測方法測定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。試驗(yàn)陽性結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 陽性結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

根據(jù)表2分析數(shù)據(jù)可知，本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)要求的傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果一致性達(dá)100%，未出現(xiàn)分子檢測方法常見的假陰、陽性現(xiàn)象，表明本方法能夠在我國現(xiàn)有食品安全要求水平下進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測，具有現(xiàn)實(shí)可行性。

3 討論與結(jié)論

LAMP基礎(chǔ)方法具有易污染、易呈假陽性、結(jié)果觀察過于主觀等缺點(diǎn)，而儀器的引進(jìn)改善了這些問題。熒光LAMP檢測儀通過收集熒光信號(hào)生成曲線，試驗(yàn)證明15 min～30 min左右即可完成曲線報(bào)告，較基礎(chǔ)LAMP技術(shù)通過濁度或顏色進(jìn)行結(jié)果觀察更具客觀性和簡便性；同時(shí)檢測過程閉蓋操作，較基礎(chǔ)LAMP技術(shù)通過后期添加染料的方法能有效減少交叉污染和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)、驗(yàn)證得到2種目標(biāo)菌株的LAMP引物，均能實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，且不同引物間及混合反應(yīng)過程中內(nèi)部干擾較小，擴(kuò)增結(jié)果分離效果較好，并且在100批次人工污染樣品的檢測中與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果統(tǒng)一性達(dá)100%，為更大規(guī)模多重檢測方法的建立提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)。本文最終確定的LAMP體系要求試劑較容易獲得；設(shè)備簡單便攜，規(guī)避了大型熒光PCR儀等儀器的使用。目前微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究水平較低，活菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不易獲得，本方法靈敏度水平約為71 CFU/mL，相比其他微生物快速檢測方法靈敏度較高。

本研究建立的多重LAMP檢測方法能夠同時(shí)對(duì)食源性金黃色葡萄球菌和沙門氏菌進(jìn)行初篩，在實(shí)際的大規(guī)模致病菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測中能夠有效縮短檢驗(yàn)時(shí)間和提高檢驗(yàn)效率，避免嚴(yán)重食品安全事件的發(fā)生和擴(kuò)散。

在食品檢測領(lǐng)域，微生物檢測項(xiàng)目根據(jù)其學(xué)科特點(diǎn)要求為不可復(fù)檢，從而采用高級(jí)別抽樣方案進(jìn)行質(zhì)量控制，由此決定了食源性致病菌的檢測工作量大、操作繁瑣、周期較長的特點(diǎn)。本研究從提高篩選效率、縮短試驗(yàn)周期方面進(jìn)行突破，建立了多重?zé)晒釲AMP檢測方法，結(jié)果證明其具有較好的普篩性、特異性和靈敏度，并具有一定的創(chuàng)新性和現(xiàn)實(shí)可行性。

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Application ofmultiple fluorescent LAMP reaction for foodborne pathogenic bacteria detection in risk monitoring

TIANHao*LI Guangyao SHI Xiaona
（Hebei dongmiaotest technologyCO.,LTD-scientific research and planningdepartment，Hebei Baoding 071000，China）

The problemoftraditional pathogenic bacteria detection method is time consuming and the large workload.The objective of the article is to solve the difficulty.Staphylococcus aureus and Salmonella were designed two sets of LAMP primers byinvAand femAsequences.The fluorescent was added tothe hybrid system.The target DNAgetted the amplification and the related curve through the constant temperature fluorescence detector.At the same time,the amplification products was analyzed through the electrophoresis apparatus，and 100 batches offood samples were tested in the end.The method has good screen and specificity.The sensitivityis 71 CFU/mL.The pollution and lowefficiencyis hard to happen in the process.The method can be applied to the beginning of the rapid screening of some food-borne pathogens.

multiple fluorescent LAMP reaction；pathogenic bacteria；food detection；rapid detection

TS207.4

A

1673-6044（2017）03-0023-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.009

*田浩，男，1990出生，2012年畢業(yè)于河北大學(xué)生物工程專業(yè)，工程師。

2017-04-18