響應(yīng)面法優(yōu)化酶促水解藍(lán)圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

周浩純 顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮*

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018）

·基礎(chǔ)研究·

響應(yīng)面法優(yōu)化酶促水解藍(lán)圓鲹蛋白制備抗凝血肽的研究*

周浩純**顧晗可 單丹婷 宋璐瑤 俞舜杰 黃光榮***

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018）

以藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物為原料，探究酶促水解制備抗凝血肽的工藝條件。研究結(jié)果表明，堿性蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的水解效果最好，經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后得到堿性蛋白酶酶促水解的最佳條件為：水解pH 7.5，水解溫度44℃，堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解時(shí)間4.2 h，響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)水解液的相對(duì)抗凝血活性值為100 AT-U/mL，3次驗(yàn)證試驗(yàn)表明，實(shí)際相對(duì)抗凝血活性為101 AT-U/mL，水解度為19.55%，與預(yù)測(cè)值接近。

藍(lán)圓鲹；抗凝血肽；酶促水解；加工副產(chǎn)物；響應(yīng)面法

藍(lán)圓鲹（Decapterus maruadsi）屬于大宗低值魚，主要分布在我國(guó)南海，數(shù)量較多，是典型的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一。藍(lán)圓鲹除鮮食外，主要用于加工制作魚罐頭、魚糜等產(chǎn)品，加工后的副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)，不易貯藏與運(yùn)輸，通常用作制備飼料，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低。由于藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)，是制備各種生物活性肽的優(yōu)良原料，如制備抗氧化肽、降血壓肽、礦物元素結(jié)合肽。目前，利用藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物制備抗凝血肽的研究尚未見報(bào)道。凝血是機(jī)體重要的生理防御過程，但在病理?xiàng)l件下可誘發(fā)血栓，繼而導(dǎo)致如肺梗塞、腦血栓、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、心肌梗塞和四肢及周圍血管栓塞等疾病，嚴(yán)重危害人類生命健康。目前市面上常見的抗血栓藥主要是化學(xué)合成西藥，也有酶制劑，如瑞替普酶等。近年來的研究表明，一些蛋白質(zhì)水解得到的生物活性肽也具有抗凝血作用，來源包括黃鰭金槍魚蛋白、蛋清粉、蝎子蛋白、蝦虎魚蛋白、紫貽貝蛋白、菲牛蛭蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物的酶促水解液具有抗凝血作用，本文主要利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶促水解藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物制備抗凝血肽的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物，浙江省溫州洞頭區(qū)水產(chǎn)品市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物→烘干→去頭→粉碎過篩→異丙醇脫脂2～3次→揮發(fā)有機(jī)試劑→烘干→粉碎過篩→低溫密封保存

1.2.2 酶促水解

稱取脫脂后的魚粉于錐形瓶中，加入一定pH的磷酸緩沖液200 mL（胃蛋白酶用KCl緩沖液），搖勻后加入一定量的蛋白酶，在恒溫水浴搖床（150 r/min）中水解一定時(shí)間后沸水浴滅酶10 min，待冷卻后離心（10 000 r/min，4℃，10 min），取上清液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白酶的篩選

選用復(fù)合蛋白酶（溫度50℃、pH7.5）、堿性蛋白酶（溫度50℃、pH8.5）、風(fēng)味蛋白酶（溫度50℃、pH7.0）、胰蛋白酶（溫度37℃、pH8.0） 分別對(duì)脫脂后的魚粉進(jìn)行酶促水解，以抗凝血活性、水解度作為指標(biāo)，篩選出最適的蛋白酶。

1.2.4 酶促水解條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：分別以水解溫度（25℃～65℃）、pH值（7.0～9.5）、蛋白酶添加量（8 000 U/g～13 000 U/g，以每g蛋白質(zhì)所需要的酶添加單位表示）、水解時(shí)間（1 h～5 h） 和魚粉添加量（2 g/L～150 g/L） 為單因素進(jìn)行水解，測(cè)定水解液的水解度和相對(duì)抗凝血活性。

響應(yīng)面優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH、水解溫度、酶添加量、水解時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化，以單因素試驗(yàn)中的較佳水平為中心點(diǎn)，運(yùn)用CCD（Central Composite Design） 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定各試驗(yàn)組的水解液相對(duì)抗凝血活性，四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平編碼值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

藍(lán)圓鲹魚粉樣品經(jīng)2.0 mol/L NaOH在80℃條件下回流水解4 h后，以6.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至中性，以福林酚法測(cè)定總蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 水解度的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)［19］中方法測(cè)定可溶性肽含量。水解度（DH）用公式計(jì)算：水解度=（可溶性肽的含量/總蛋白的含量）×100%。

1.3.4 相對(duì)抗凝血活性的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)［17］中方法測(cè)定抗凝血活性，以相對(duì)值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

重復(fù)3次試驗(yàn)，最終結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)圖在Origin 8.5軟件下完成。響應(yīng)面分析在Design Expert 8.0軟件下完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

以常見的4種商業(yè)化蛋白酶對(duì)脫脂后的藍(lán)圓鲹加工副產(chǎn)物進(jìn)行酶促水解，測(cè)定其水解度和抗凝血活性，結(jié)果如下頁圖1所示。從圖1可以看出，堿性蛋白酶具有更高水解效率，其水解度最高，其次是復(fù)合蛋白酶；堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解液具有同等的抗凝血活性，結(jié)合水解度，最后選擇堿性蛋白酶為水解酶，研究其最佳水解條件。

2.2 單因素試驗(yàn)

圖1 不同蛋白酶水解液的水解度和抗凝血活性的影響

試驗(yàn)研究了魚粉添加量、堿性蛋白酶添加量、水解溫度、pH和水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)酶促水解過程的影響，測(cè)定水解液的抗凝血活性和水解度，結(jié)果如圖2～6所示。由圖2可知，魚粉添加量與水解液抗凝血活性沒有明顯規(guī)律，當(dāng)魚粉添加量在5 g/L和20 g/L時(shí)抗凝血活性明顯高于其他水平，而水解度隨著魚粉的增加而降低。由圖3可知，水解度隨堿性蛋白酶添加酶量先增加，然后趨于平衡，而抗凝血活性則在酶添加量為9 000 U/g時(shí)最高。由圖4可知，水解度在水解時(shí)間為40℃時(shí)最高，但水解液的抗凝血活性在40℃和50℃時(shí)均表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)。由圖5可知，水解度在pH8.5及以后表現(xiàn)出較高值，這是堿性蛋白酶的特點(diǎn)，但水解液的抗凝血活性卻并未出現(xiàn)有規(guī)律的變化，在pH7.0和pH8.0時(shí)表現(xiàn)出較大相對(duì)抗凝血活性。從圖6可知，水解時(shí)間越長(zhǎng)，抗凝血活性越高，但在4 h后有明顯下降，水解度也隨著水解時(shí)間增加而增加，但在3 h后逐漸減小。因此，通過單因素試驗(yàn)確定下一步響應(yīng)面優(yōu)化水解條件的因素為堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間和pH，其中心點(diǎn)分別為9 000 U/g、40℃、4 h、和8.0。

圖2 魚粉添加量對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

圖3 酶添加量對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

圖4 水解溫度對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

圖5 pH對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件

圖6 水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)水解的影響

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以響應(yīng)面CCD設(shè)計(jì)，試驗(yàn)了堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間和pH對(duì)水解液抗凝血活性的影響，共29個(gè)試驗(yàn)，其中中心點(diǎn)5個(gè)，按表2順序進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定水解液的抗凝血活性，結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件，以抗凝血活性為響應(yīng)值，酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間和pH為變量，進(jìn)行二次回歸模型分析，得到預(yù)測(cè)模型公式為：

抗凝血活性=+563.365 23-128.808 89X1+2.321 81X2-0.024 253X3+12.166 67X4-0.355 56X1X2-3.780 09E-017X1X3-2.000 00X1X4+1.15266E-018X2X3-0.333 33X2X4+1.000 00E-003X3X4+9.813 33X12+0.030 288X22+8.533 33E-007X32+2.583 33X42，其中X1為pH，X2為水解溫度（℃），X3為酶添加量（U/g），X4為水解時(shí)間 （h）。

對(duì)影響水解過程的4個(gè)因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

由表3可知，4個(gè)因素的顯著性影響大小依次為：水解溫度＞pH＞水解時(shí)間＞酶添加量。其中水解溫度這一因素表現(xiàn)為極顯著，因此可看出溫度對(duì)于水解液抗凝血活性的影響非常大；該模型中只有酶添加量這一個(gè)因素為不顯著，分析原因可能是所加的酶量均達(dá)到或接近飽和。用Design Expert8.0軟件預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)水解條件為：堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解溫度44℃，水解時(shí)間4.2 h和水解pH7.5，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得該條件下藍(lán)圓鲹水解液的相對(duì)抗凝血活性達(dá)100 AT-U/mL，與預(yù)測(cè)值101 AT-U/mL非常接近。此時(shí)，水解液的水解度為19.55%。

3 結(jié)論

藍(lán)圓鲹是我國(guó)南海經(jīng)濟(jì)魚類之一，加工后的副產(chǎn)物含有大量的蛋白質(zhì)，是一種較好的蛋白質(zhì)資源。本文以藍(lán)圓鲹加工后的副產(chǎn)物為原料，脫脂后經(jīng)過酶促水解，制備成具有抗凝血作用的水解液。結(jié)果表明，堿性蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的水解效果最好，經(jīng)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的水解條件為：水解pH 7.5，水解溫度44℃，堿性蛋白酶添加量9 500 U/g，水解時(shí)間4.2 h，在此條件下進(jìn)行水解，相對(duì)抗凝血活性可達(dá)到100 AT-U/mL，水解度可達(dá)19.55%。

［1］蔣日進(jìn)，徐漢祥，金海衛(wèi)，等.東海藍(lán)圓鲹的攝食習(xí)性［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36（2）:216-227.

［2］劉光明，李曉燕，胡家偉，等.一種藍(lán)圓鲹罐頭的加工方法：中國(guó)，CN201510223447.X［P］.2015-08-26.

［3］張浩.藍(lán)圓鲹冷凍魚糜加工關(guān)鍵工藝研究［D］.福州:福建農(nóng)林大學(xué)，2014.

［4］蔣海萍.藍(lán)圓鲹蛋白制備抗氧化肽的研究［D］.南寧:廣西大學(xué)，2014.

［5］何婷.藍(lán)圓鲹蛋白控制酶解及酶解物抗氧化特性研究［D］.廣州:華南理工大學(xué)，2008.

［6］楊燊，郝更新，陳申如，等.藍(lán)圓鲹酶解條件的響應(yīng)面法優(yōu)化及其產(chǎn)物抗氧化活性的研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12（8）:32-40.

［7］JIANG H P，TONG T Z，SUN J H，et al.Purification and characterization of antioxidative peptides from round scad（Decapterus maruadsi） muscle protein hydrolysate ［J］.Food Chemistry，2014，154（2）:158-163.

［8］舒冰.酶解藍(lán)圓鲹蛋白制備降血壓肽的研究［D］.南寧:廣西大學(xué)，2012.

［9］ ZHANG W T，LI Y N，ZHANG J，et al.Optimization of Hydrolysis Conditions for the Production of Iron-Binding Peptides from Scad （Decapterus maruadsi） Processing Byproducts ［J］.American Journal of Biochemistry and Biotechnology，2016，12（4）:220-229.

［10］SCHWIENHORST A.Direct thrombin inhibitors:a survey of recent developments ［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2006，9（63）:150-160.

［11］AGHAABDOLLAHIAN S，RABBANI M，GHAEDI K，et al.Molecular cloning of Reteplase and its expression in E.coliusing tacpromoter ［J］.Advanced Biomedical Research，2014，3:190-190.

［12］NIRANJAN R，JUNG W K，ERESHA M，et al.A Novel AnticoagulantPurified from Fish Protein Hydrolysate Inhibits Factor Ⅶ and Platelet Aggregation ［J］.Life Science，2005，76（22）:2 607-2 619.

［13］劉靜波，王菲，王翠娜，等.Alcalase酶解蛋清粉制備抗凝血肽的工藝優(yōu)化［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2012，42（1）:250-255.

［14］REN Y，WU H，LAI F R，et al.Isolation and identification of a novel anticoagulant peptide from enzymatic hydrolysates of scorpion （Buthus martensii Karsch）protein ［J］.Food Research International，2014，64:931-938.

［15］NASRI R，AMOR I B，BOUGATEF A，et al.Anticoagulant activities of goby muscle protein hydrolysates ［J］.Food Chemistry，2012，133（3）:835-841.

［16］JUNG W K，KIM S K.Isolation and characterization of an anticoagulant oligopeptide from blue mussel，Mytilus edulis［J］.Food Chemistry，2009，117（4）:687-692.

［17］鐘超.菲牛蛭抗凝血肽的酶法制備及其活性研究［D］.廣州:華南理工大學(xué)，2012.

［18］PARK K A，CHOI Y M，KANG S，et al.Effects of Proteins on the Reactivity of Various Phenolic Compounds with the Folin-Ciocalt Reagent［J］.Korean Journal of Food Science&Technology，2015，47（3）:299-305.

［19］ADLER-NISSEN J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1979，27（6）:1 256-1 262.

Optimization ofenzymatic hydrolysis of Decapterus maruadsi protein for anticoagulant peptides production by response surface methodology*

ZHOUHaochun**GUHankeSHANDantingSONGLuyaoYUShunjieHUANGGuangrong***
（College oflife sciences，China jilianguniversity，ZhejiangHangzhou 310018，China）

The anticoagulant peptides fromblue scad(Decapterus maruadsi)processingby-products byenzymatic hydrolysis were investigated in this paper.The results showed that alcalase was the best choice for producinganticoagulant peptides fromblue scad processingby-products.The best hydrolysis conditions were optimized bysingle-factor-experiment and response surface methodology(RSM)as following:hydrolysis pH 7.5,hydrolysis temperature of44℃,alcalase addition of 9 500 U/g and hydrolysis time of 4.2 h.The relative anticoagulant activity by the RSMprediction model was 100 AT-U/mL,which was veryclose tothat ofthree verification experiments,101 AT-U/mL,and the degree ofhydrolysis was 19.55%at the best hydrolysis conditions.

Decapterus maruadsi；anticoagulant peptides；enzymatic hydrolysis；processing by-products；response surface methodology

TS254.4

A

1673-6044（2017）03-0052-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2017.03.016

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610356004）

**周浩純，女，1996年出生，中國(guó)計(jì)量大學(xué)食品質(zhì)量與安全專業(yè)在讀本科。

*** 黃光榮，通訊作者，E-mail：grhuang@126.com.

2017-04-18