鄰苯二甲醛柱前在線衍生反相高效液相色譜法測定功能飲料中賴氨酸的含量

李燦明，柏建國，劉桂果，孫麗鵬，程東，白燕楠

（奧瑞金包裝股份有限公司，北京 101407）

鄰苯二甲醛柱前在線衍生反相高效液相色譜法測定功能飲料中賴氨酸的含量

李燦明，柏建國，劉桂果，孫麗鵬，程東，白燕楠

（奧瑞金包裝股份有限公司，北京 101407）

以鄰苯二甲醛作為衍生試劑，結(jié)合柱前在線衍生–反相高效液相色譜技術(shù)，建立了一種快速檢測功能飲料中賴氨酸含量的分析方法。對流動相梯度洗脫程序、DAD檢測波長和在線衍生時間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。賴氨酸在1～200 mg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998，賴氨酸的檢出限為0.3 mg/L，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7% (n=5)，加標(biāo)回收率為96.43%～115.01%。該方法可應(yīng)用于功能飲料中賴氨酸的快速檢測。

反相高效液相色譜；功能飲料；賴氨酸；鄰苯二甲醛；柱前在線衍生

賴氨酸是人體必需的八種氨基酸之一［1］，常作為功能成分應(yīng)用于功能飲料，功能飲料中賴氨酸的含量是產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。氨基酸分析方法有化學(xué)滴定法［2］、電化學(xué)分析法［3–4］、光譜分析法［5–6］和色譜分析法［7–18］等，其中高效液相色譜分析法應(yīng)用最為廣泛。由于氨基酸具有極性大、無紫外和熒光信號等特點，高效液相色譜分析法一般需要聯(lián)合衍生化反應(yīng)。目前常用的柱前衍生劑有鄰苯二甲醛（OPA）［7–12］、異硫氰酸苯酯（PITC）［13–15］、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）［16］、氯甲酸芴甲酯（FMOC–Cl）［7–8］和二硝基氟苯（FDNB）［17］等。其中OPA衍生化具有衍生步驟簡單、反應(yīng)速率大等特點，應(yīng)用最為普遍。OPA衍生化時間過短，則反應(yīng)不充分；衍生化時間過長，則生成的衍生物會降解［9，12］。故必須精確控制OPA的衍生化時間，而在實際操作中卻很難實現(xiàn)。美國安捷倫科技有限公司的Agilent 1290型高效液相色譜自動進(jìn)樣器可以執(zhí)行自動程序進(jìn)樣（在線衍生化），能夠精確控制在線衍生化時間，可以與OPA衍生化形成互補(bǔ)。

筆者以O(shè)PA為衍生試劑，采用在線衍生反相高效液相色譜技術(shù)，建立了一種快速檢測功能飲料中賴氨酸含量的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1290 Infinity型，附DAD紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：AL204型，感量0.000 1 g，梅特勒–托利多儀器（上海）有限公司；

賴氨酸對照品：純度為99.8%，中國食品藥品檢定研究院；

甲醇、乙腈：色譜純；

硼酸、OPA、氫氧化鈉：分析純；

硼酸鈉緩沖液：0.4 mol/L，稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉，用水溶解并定容至100 mL；

OPA衍生溶液：稱取0.1 g OPA，用10 mL甲醇溶解，以0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100 mL；

功能飲料：市售；

實驗用水為Milli-Q超純水器制得。

1.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司）；進(jìn)樣體積：1 μL；自動程序進(jìn)樣（在線衍生）：吸取0.5 μL衍生劑→清洗注射器→吸取1 μL樣品→清洗注射器→吸取0.5 μL衍生劑→清洗注射器→混合→等待10 min→進(jìn)樣；柱溫箱溫度：40℃；檢測波長：330 nm；流動相：水–甲醇–乙腈，流量為0.4 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液

稱取50 mg(精確至0.1 mg)賴氨酸，用水溶解后移入50 mL容量瓶中，用水定容至標(biāo)線，混勻，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

準(zhǔn)確移取適量的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為 1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 mg/L的系列賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 實驗方法

將功能飲料稀釋一定的倍數(shù)，過濾后裝入液相小瓶A，將衍生劑過濾后裝入液相小瓶B。根據(jù)1.2色譜條件中的自動進(jìn)樣程序進(jìn)行在線衍生并進(jìn)樣檢測，以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1 流動相

GB/T 5009.169–2003高效液相色譜法測定?；撬岬牧鲃酉囿w系為甲醇–乙腈–水［19］，鑒于賴氨酸與?；撬峋哂邢嗨频陌被峤Y(jié)構(gòu)，故采用甲醇–乙腈–水作為賴氨酸測定的流動相體系。

參考GB/T 5009.169–2003的流動相洗脫程序，設(shè)計了兩種等度洗脫程序（表2和表3）和一種梯度洗脫程序（表1），試驗結(jié)果表明，低有機(jī)相等度洗脫在1～5 min未出現(xiàn)賴氨酸衍生物的洗脫峰；高有機(jī)相等度洗脫在0.5～0.8 min出現(xiàn)一洗脫峰，該洗脫峰峰形極差，這主要是因為高有機(jī)相致使賴氨酸衍生物和其它相關(guān)產(chǎn)物出現(xiàn)共洗脫所致；而在梯度洗脫條件下，于2.8 min出現(xiàn)賴氨酸衍生物的洗脫峰，該洗脫峰峰形較好且與基線分離。綜上，流動相洗脫采用表1的梯度洗脫程序。

表2 流動相等度洗脫程序（低有機(jī)相）

表3 流動相等度洗脫程序（高有機(jī)相）

2.1.2 檢測波長

將賴氨酸與OPA進(jìn)行柱前在線衍生，衍生反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)C18柱分離后進(jìn)入DAD檢測器進(jìn)行紫外3D光譜掃描，得到賴氨酸衍生物的紫外吸收3D光譜圖如圖1。由圖1可知，賴氨酸衍生物的保留時間約為2.8 min，其最佳吸收波長約為330 nm，故選擇DAD檢測器的檢測波長為330 nm。

圖1 賴氨酸衍生物的紫外吸收3D光譜圖

2.1.3 衍生劑及在線衍生時間

OPA是目前應(yīng)用最為廣泛的氨基酸柱前衍生劑，其發(fā)生衍生化反應(yīng)時，通常需要加入巰基乙醇、巰基丙酸或乙硫醇等［7–11］，該類物質(zhì)具有穩(wěn)定性差、有強(qiáng)烈刺激性氣味等問題。本方法選擇OPA直接與賴氨酸進(jìn)行衍生反應(yīng)，不添加上述巰基類物質(zhì)。

在室溫條件下，以在線衍生化時間為橫坐標(biāo)，以衍生化反應(yīng)所生成的賴氨酸衍生物相對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得到鄰苯二甲醛與賴氨酸衍生反應(yīng)的在線衍生速率圖，如圖2所示。由圖2可知，隨著衍生時間的增加，衍生物含量明顯增加，在10 min和40 min時存在兩個速率拐點，1～10 min的反應(yīng)速率依次大于10～40 min的反應(yīng)速率和40～60 min的反應(yīng)速率。該衍生速率圖與凌笑梅等［12］研究的衍生反應(yīng)速率圖（25℃）基本一致。

圖2 鄰苯二甲醛在線衍生速率

衍生時間過短，產(chǎn)生的衍生物含量較少，從而導(dǎo)致分析靈敏度降低；衍生時間過長，不利于提高檢測效率。綜合考慮分析靈敏度和檢測效率，在線衍生化時間選擇10 min。

2.2 方法評價

2.2.1 線性方程和檢出限

將賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，按1.4實驗方法進(jìn)行檢測，以信噪比(S/N)大于或等于3計算該方法的檢出限。在1.2色譜條件下測定系列賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。線性范圍、線性方程和檢出限見表4。由表4可知，賴氨酸檢出限為0.3 mg/L，其在1～200 mg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.998 3。

表4 線性范圍、線性方程和檢出限

2.2.2 精密度和準(zhǔn)確度

取某功能飲料樣品，稀釋至10倍體積，測得該功能飲料稀釋液的賴氨酸含量，以此功能飲料稀釋液作為基質(zhì)，對其進(jìn)行兩個濃度水平的賴氨酸加標(biāo)回收試驗，兩個不同濃度水平分別為10 mg/L和100 mg/L，對每個水平進(jìn)行5次重復(fù)測定，基質(zhì)加標(biāo)色譜圖見圖3，加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表5。由表5可知，該方法的加標(biāo)回收率在96.43%～115.01%之間，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7% (n=5)，可見該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

圖3 功能飲料基質(zhì)加標(biāo)色譜圖

表5 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

以鄰苯二甲醛為衍生試劑，采用在線衍生反相高效液相色譜技術(shù)，建立了一種快速檢測功能飲料中賴氨酸含量的分析方法。該方法精密度和準(zhǔn)確度均較好，可以應(yīng)用于功能飲料中賴氨酸含量的快速檢測。

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賽默飛寨卡病毒測試包獲FDA緊急使用授權(quán)

不久前，美國食品和藥品監(jiān)督管理局向賽默飛世爾科技的TaqPath寨卡病毒包提供了緊急使用授權(quán)。

該試劑盒由美國CLIA認(rèn)證的實驗室進(jìn)行授權(quán)，僅用于定性檢測寨卡病毒的RNA，并對與患者匹配的血清樣本一起收集的人血清和尿液診斷寨卡病毒感染。接受測試的個人必須符合美國疾病控制和預(yù)防中心寨卡病毒臨床或流行病學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

賽默飛世爾研究人員指出，該套件是凍干格式，完整的測試工作流程包括用于自動提取樣品的King Fisher Flex系統(tǒng)和QuantStudio Dx實時PCR系統(tǒng)。

美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部長宣布，存在這樣的情況，證明需要緊急使用體外診斷測試來檢測寨卡病毒或診斷寨卡病毒感染。當(dāng)HHS秘書聲明終止時，EUA將終止，除非FDA立即撤銷。

賽默飛世爾科技遺傳科學(xué)總裁Mark Smedley在一份聲明中說：“與以前的疫情一樣，我們的應(yīng)對集中在提供標(biāo)準(zhǔn)化測試解決方案，簡化實驗室解決公共衛(wèi)生威脅的工作流程。

（儀器信息網(wǎng)）

70萬食品安全專項資金投入網(wǎng)絡(luò)訂餐面臨監(jiān)測“拷問”

時代在進(jìn)步，從最初的互聯(lián)網(wǎng)訂票，到如今的互聯(lián)網(wǎng)點餐，在當(dāng)今大數(shù)據(jù)時代，相信在不久的將來，互聯(lián)網(wǎng)訂餐會成為更多行業(yè)的一張新“名片”。新型“互聯(lián)網(wǎng)+”訂餐服務(wù)的上線，引進(jìn)社會品牌餐飲，在飲食上提供了更多的選擇。

網(wǎng)上訂餐火爆的同時，顯示出商家的良莠不齊，其中蘊含的風(fēng)險也越來越大，比如食品衛(wèi)生問題、監(jiān)管問題、價格問題等。如何保障網(wǎng)絡(luò)訂餐的食品安全，成為消費者關(guān)注的熱點問題，對職能部門來說也是一項全新的任務(wù)和挑戰(zhàn)。

不久前，在北京市食藥監(jiān)局指導(dǎo)下，美團(tuán)點評、餓了么、百度外賣、到家美食會等4家主要網(wǎng)絡(luò)訂餐平臺食品安全專項基金成立。該基金將用來聘請第三方機(jī)構(gòu)開展食品安全風(fēng)險監(jiān)測、食安防護(hù)措施研發(fā)等事項。當(dāng)日網(wǎng)絡(luò)訂餐平臺自律共建聯(lián)盟宣布，自聯(lián)盟成立以來已主動下線5 000余家商戶。具體來說，各網(wǎng)絡(luò)訂餐平臺可自行選取或統(tǒng)一選取具備專業(yè)檢測資質(zhì)的機(jī)構(gòu)開展食品安全風(fēng)險監(jiān)測，制定年度抽檢計劃，并向食品藥品監(jiān)管部門及時通報風(fēng)險監(jiān)測結(jié)果，進(jìn)行風(fēng)險分析，助力監(jiān)管，推動食品安全共治；監(jiān)測結(jié)果將作為網(wǎng)絡(luò)訂餐平臺對入網(wǎng)店鋪實施品牌推介、服務(wù)優(yōu)選激勵的條件依據(jù)，也是發(fā)布消費提示等服務(wù)措施的重要依據(jù)。

在新形勢下，完善的監(jiān)管法規(guī)，是監(jiān)管行為探索與實踐的法制保障。國家食藥監(jiān)總局法制司、國家食品藥品稽查專員陳谞表示，中國網(wǎng)絡(luò)食品交易立法正在加緊制定和完善中。2015年實施的新版《食品安全法》明確了網(wǎng)絡(luò)食品交易的平臺責(zé)任；2016年7月，總局發(fā)布實施《網(wǎng)絡(luò)食品安全違法行為查處辦法》，針對網(wǎng)絡(luò)食品交易兩種業(yè)態(tài)——食品生產(chǎn)經(jīng)營者自營模式和網(wǎng)絡(luò)第三方交易服務(wù)平臺模式設(shè)定了各自的義務(wù)和責(zé)任，并對網(wǎng)售食品違法行為的處罰進(jìn)行了細(xì)化和強(qiáng)化。

國家食藥監(jiān)總局正在進(jìn)一步完善《網(wǎng)絡(luò)餐飲服務(wù)監(jiān)督管理辦法》，將對網(wǎng)絡(luò)訂餐平臺的資質(zhì)、責(zé)任、監(jiān)管要求，送餐人員的管理，以及中央廚房、共享家廚等新興互聯(lián)網(wǎng)餐飲模式，進(jìn)一步明確和規(guī)范。應(yīng)用“互聯(lián)網(wǎng)+”檢驗檢測技術(shù)，推進(jìn)食品安全檢驗檢測新業(yè)態(tài)發(fā)展，加強(qiáng)食品安全第三方檢驗機(jī)構(gòu)建設(shè)，打造“食品安全云服務(wù)平臺”，構(gòu)建以大數(shù)據(jù)為支撐的食品安全社會共治新模式任重道遠(yuǎn)。遠(yuǎn)離“網(wǎng)上高大上、網(wǎng)下臟亂差”正是網(wǎng)絡(luò)食品市場最真實的訴求。

（中國分析計量網(wǎng)）

Analytica China 2018展位預(yù)定中

第九屆慕尼黑上海分析生化展（Analytica China 2018）將于2018年10月31日–11月2日在上海新國際博覽中心E1–E4館召開。由原來的3個館擴(kuò)大至4個館，參展企業(yè)將達(dá)1 000家，展示面積預(yù)計達(dá)46 000平米。本屆展會的展商報名數(shù)量較analytica China 2016同期增長超過70%。行業(yè)內(nèi)知企業(yè)品牌已紛紛確定參展意向，并牢牢占據(jù)各展區(qū)的重要位置，除原有生命科學(xué)、生物技術(shù)與診斷，分析與質(zhì)量控制，實驗室裝備與技術(shù)，食品安全裝備與技術(shù)展區(qū)外，新增設(shè)的環(huán)境監(jiān)測主題展區(qū)也異?；鸨?。

參展報名詳情可致電021–20205543；發(fā)送郵件至ac@mm-sh.com進(jìn)行問詢；關(guān)注微信：analyticaChina。

Determination of Lysine in Functional Beverage by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography witho-phthalaldehyde Online Pre-column Derivatization

Li Canming, Bai Jianguo, Liu Guiguo, Sun Lipeng, Cheng Dong, Bai Yannan
（ORG Packaging Co., Ltd., Beijing 101407, China）

A fast analysis method was developed to determine the content of lysine in functional beverage by RPHPLC witho-phthalaldehyde online pre-column derivatization. The gradient elution program of mobile phase, DAD detection wavelength and online derivatization time were optimized. The calibration curve of lysine displayed good linearity with the chromatogrphy peak area in the range of 1–200 mg/L with the correlation coefficient more than 0.998. The detection limit of lysine was 0.3 mg/L. The relative standard deviation was less than 7% (n=5), and the recoveries ranged from 96.43% to 115.01%. This method can be used to determine the content of lysine in functional beverage.

reversed-phase high performance liquid chromatography; functional beverage; lysine;o-phthalaldehyde;online pre-column derivatization

O657.7

A

1008–6145(2017)05–0085–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.022

聯(lián)系人：李燦明；E-mail: 13581782262@139.com

2017–06–23