固相萃取–高效液相色譜法測(cè)定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的殘留量

蘆智遠(yuǎn) ，馮歆軼 ，汪靜雯 ，徐斐 ，楊琦

(1.西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，西安 710065； 2.陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，西安 710100)

固相萃取–高效液相色譜法測(cè)定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的殘留量

蘆智遠(yuǎn)1，馮歆軼1，汪靜雯2，徐斐1，楊琦1

(1.西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，西安 710065； 2.陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，西安 710100)

建立了測(cè)定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的固相萃取–高效液相色譜法。樣品以0.1 mol/L的鹽酸溶液為提取劑，經(jīng)C18固相萃取柱凈化處理，以乙腈–10 mmol/L乙酸銨水溶液(體積比25∶75)為流動(dòng)相，TechMate C18–ST色譜柱分離，4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)分別為228 nm和267 nm，色譜峰面積外標(biāo)法定量。在0.50～100.00 mg/L濃度范圍內(nèi)，4-氯苯氧乙酸鈉的相關(guān)系數(shù)為0.999 8，精密度在1.3%～8.2%之間（n=6），回收率在103.1%～109.0%之間；在0.05～10 mg/L濃度范圍內(nèi)，6-芐基腺嘌呤相關(guān)系數(shù)為0.999 9，精密度在0.9%～3.8%之間（n=6），回收率在88.0%～95.4%之間。4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的檢出限(S/N=3)分別為0.24，0.02 mg/kg。該法可以同時(shí)完成豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的分析檢測(cè)。

豆芽；4-氯苯氧乙酸鈉；6-芐基腺嘌呤；高效液相色譜法；固相萃取

豆芽富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、鈣、維生素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，為廣大消費(fèi)者所喜愛(ài)，市場(chǎng)需求量大［1］。為了促進(jìn)豆芽萌發(fā)，栽培中濫用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的現(xiàn)象頻繁發(fā)生，其中常見(jiàn)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有4-氯苯氧乙酸鈉，6-芐基腺嘌呤等。4-氯苯氧乙酸鈉(4-Chlorphenoxyacetic acid sodium，CPANa)又名防落素，為白色針狀或棱狀結(jié)晶，易溶于水，性質(zhì)穩(wěn)定。據(jù)研究，攝入CPA-Na會(huì)導(dǎo)致兒童發(fā)育早熟、女性生理發(fā)生變化、老年人骨質(zhì)疏松，甚至誘發(fā)致癌、致畸等嚴(yán)重后果［2–3］。6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurin，6-BA)屬細(xì)胞分裂素，白色或類白色晶體，難溶于水，微溶于乙醇，在酸、堿中性質(zhì)穩(wěn)定。6-BA具有一定的毒性，人體過(guò)量攝入會(huì)使食道、胃黏膜受到損傷，引發(fā)惡心、嘔吐等現(xiàn)象［4–5］。2011年，衛(wèi)生部監(jiān)督函919號(hào)公告中規(guī)定6-芐基腺嘌呤不得在豆芽生產(chǎn)中使用，同時(shí)GB 2760–2011，GB 2760–2014中取消了其作為食品添加劑的使用限量。

CPA-Na和 6-BA 的檢測(cè)方法有液相色譜法［6–10］、液相色譜 – 質(zhì)譜聯(lián)用法［11–12］、離子色譜法［13］、薄層色譜法［14］、毛細(xì)管電泳法［15］等，其中液相色譜法的應(yīng)用相對(duì)廣泛。然而上述方法多是針對(duì)一種化合物進(jìn)行分析，無(wú)法同時(shí)測(cè)定兩種化合物。筆者擬采用固相萃取–高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定豆芽中CPANa和6-BA的殘留量，通過(guò)建立極性環(huán)境的提取條件，比較不同類型固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物的保留效果，分析不同流動(dòng)相和添加劑對(duì)CPA-Na和6-BA分離的影響，從而建立一種操作簡(jiǎn)單、分析準(zhǔn)確的CPANa和6-BA的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1260型，配有二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

離心機(jī)：Anke型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

固相萃取裝置：VISPREP型，美國(guó)Supelco公司；

固相萃取柱：C18，HLB 型，200 mg/(6 mL)，德國(guó)CNW公司；

陰離子交換柱：Oasis MAX混合型，150 mg/(6 mL)，美國(guó) Waters公司；

高速分散均質(zhì)機(jī)：FJ 200–S型，上海標(biāo)本模型廠；

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純；

鹽酸、乙酸銨：優(yōu)級(jí)純；

磷酸二氫鈉：分析純；

CPA-Na，6-BA：純度均為99%，源葉生物有限公司；

綠豆：購(gòu)于陜西野森林食品有限公司，在實(shí)驗(yàn)室發(fā)制豆芽用作空白樣品；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

CPA-Na標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL，以甲醇為溶劑配制；

6-BA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL，以甲醇為溶劑配制；

CPA-Na與6-BA混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：各取CPANa與6-BA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制并于4℃冰箱中避光儲(chǔ)存。

1.3 液相色譜條件

色 譜 柱：TechMate C18–ST柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：CPA-Na 228 nm，6-BA 267 nm ；流動(dòng)相：乙腈 –0.01 mol/L 乙酸銨 (25∶75)；流量：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.4 樣品前處理

將豆芽粉碎，打漿，取樣品2.0 g，用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL，均質(zhì)提取1 min，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液備用。

在固相萃取裝置上安裝C18小柱，用3 mL甲醇活化小柱，用3 mL水平衡后吸取3 mL上清液過(guò)柱，控制流量為2～3 mL/min，然后用3 mL水淋洗，最后用3 mL甲醇洗脫收集，混勻后供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

CPA-Na易溶于水，6-BA難溶于水，但6-BA中的腺嘌呤基團(tuán)是一類含有兩個(gè)相鄰的碳氮環(huán)的含氮化合物，從而使6-BA具有堿性化合物的特性，因此可以通過(guò)降低水系提取溶液的pH值，增加6-BA在水中的溶解度。在溫度25℃條件下，采用平衡法測(cè)定6-BA在0～0.5 mol/L鹽酸溶液中的溶解度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸濃度對(duì)6-BA溶解度的影響

由表1可知，當(dāng)鹽酸濃度小于0.1 mol/L時(shí)，6-BA溶解度隨鹽酸濃度增大而增大；當(dāng)鹽酸濃度高于0.1 mol/L時(shí)，6-BA的溶解度基本不變。因此確定提取溶劑中鹽酸的濃度為0.1 mol/L。

2.2 固相萃取柱的選擇

分別選取HLB，C18，MCX，MAX 4種固相小柱，以10 mg/kg加標(biāo)空白樣品的回收率為指標(biāo)，分析比較CPA-Na和6-BA使用不同固相萃取柱凈化的效果。HLB，C18型固相萃取小柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水進(jìn)行活化平衡處理，3.0 mL樣品過(guò)柱，加入3.0 mL水淋洗小柱，棄去淋洗液，加入3.0 mL甲醇，收集流出液，供HPLC分析；MCX柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水進(jìn)行活化平衡處理，3.0 mL樣品過(guò)柱，依次加入3.0 mL水、3.0 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，使用2.0 mL 5%氨水的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮吹至近干，加入3 mL甲醇，震蕩后供HPLC分析；MAX柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水進(jìn)行活化平衡處理，3.0 mL樣品過(guò)柱，依次加入3.0 mL水、3.0 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，使用2.0 mL 2%甲酸的甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，40℃下氮吹至近干，加入3 mL甲醇，震蕩后供HPLC分析。

經(jīng)過(guò)C18，HLB，MCX，MAX 4種固相萃取柱前處理后，比較CPA-Na和6-BA的回收率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 HLB，C18，MCX，MAX固相萃取柱前處理后CPA-Na、6-BA的回收率

由圖1可知，MCX柱對(duì)CPA-Na不能有效保留，而6-BA回收率良好，MAX柱僅CPA-Na回收率較好，因此離子交換法不適用于CPA-Na和6-BA的同時(shí)富集；采用HLB和C18小柱，兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的回收率均較好，但相對(duì)C18，HLB成本較高，因此采用C18柱作為CPA-Na和6-BA的固相萃取柱。

2.3 流動(dòng)相和添加劑

以100 mg/L CPA-Na與10 mg/L 6-BA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為待測(cè)液，比較乙腈–水、甲醇–水兩種流動(dòng)相，及 10 mmol/L 乙酸銨、1% 甲酸、10 mmol/L磷酸二氫鈉3種添加劑在不同流動(dòng)相配比條件下對(duì)CPA-Na和6-BA分離的影響。CPA-Na的掃描波長(zhǎng)為228 nm，6-BA的掃描波長(zhǎng)為267 nm。流動(dòng)相組成、配比及色譜峰及分離情況見(jiàn)表2。由表2可知，以乙腈–10 mmmol/L乙酸胺(25∶75)為流動(dòng)相，CPA-Na和6-BA可以得到有效分離，且目標(biāo)物峰型良好，響應(yīng)強(qiáng)度較高，色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 流動(dòng)相組成及配比、色譜峰及分離情況

圖2 流動(dòng)相為乙腈–10 mmmol/L乙酸胺(25∶75)的色譜圖

2.4 線性范圍、檢出限

CPA-Na和6-BA標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別在 0.50～100.00，0.05～10.00 mg/L 范 圍 內(nèi) 與 對(duì) 應(yīng)的色譜峰面積線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8，0.999 9，表明兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑線性均良好。選取未檢出CPA-Na和6-BA的豆芽作為空白基質(zhì)，在1.0 mg/kg的添加水平下，以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，得到CPA-Na的檢出限為0.24 mg/kg，6-BA的檢出限為0.02 mg/kg。

2.5 加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)

以空白樣品作為基質(zhì)，添加含量分別為1，10，50 mg/kg的加標(biāo)樣品，平行測(cè)定 6次，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，CPA-Na測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～8.2% (n=6)，平均加標(biāo)回收率為103.1%～109.0%；6-BA測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.8% (n=6)，平均加標(biāo)回收率為88.0%～95.4%，可滿足分析要求。

表3 CPA-Na和6-BA的精密度及回收率(n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)降低水系提取溶劑的pH值，使用酸性水溶液提取豆芽中CPA-Na和6-BA，以固相萃取技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，建立了測(cè)定豆芽中CPA-Na和6-BA殘留量的高效液相色譜法。該方法操作便捷，可以同時(shí)完成CPA-Na和6-BA的分析檢測(cè)，回收率高，精密度好，檢出限低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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Determination of Residual of 4-Chlorobenzene Sodium Acetate and 6-Benzyladenine in Bean Sprout by SPE-HPLC

Lu Zhiyuan1, Feng Xinyi1, Wang Jingwen2, Xu Fei1, Yang Qi1
(1. Xi’an Product Quality Supervision and Inspection Institute, Xi’an 710065, China;2. College of Life Science and Food Engineering Shanxi Xueqian Normal University, Xi’an 710100, China)

The SPE-HPLC method for determination of 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzyladenine in bean sprout was established. Samples were extracted with 0.1 mol/L hydrochloric acid and purified by C18SPE column. The target compounds were separated by TechMate C18–ST column with acetonitrile–10 mmol/L ammonium acetate solution (25∶75)as mobile phase. The UV detection wavelength of 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzyladenine were 228 nm and 267 nm, respectively. The determinaion was performed by peak area with external standard method. The results showed that the linear range of 4-chlorobenzene sodium acetate was 0.5–100.00 mg/L with the linear correlation coefficients of 0.999 8,RSD of determination results were 1.3%–8.2% and the recoveries were ranged from 103.1% to 109.0%; the linear range of 6-benzyladenine was 0.05–10 mg/L (n=6) with the linear correlation coefficients of 0.999 9, RSD of determination results were 0.9%–3.8% (n=6) and the recoveries were ranged from 88.0% to 95.4%. The method detection limit of 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzyladenine were 0.24 mg/kg and 0.02 mg/kg, respectively. The method can be used to analyze 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzylaminopurin in bean sprouts at the same time.

bean sprout; 4-chlorobenzene sodium acetate; 6-benzylaminopurin; high performance liquid chromatography; solid phase extraction

O657.7

A

1008–6145(2017)05–0055–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.014

聯(lián)系人：蘆智遠(yuǎn)；E-mail: 65651736@qq.com

2017–07–31