液相色譜–同位素稀釋質(zhì)譜法測定人體生長激素＊

金有訓(xùn)，石蓮花，武利慶，王晶

（中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

液相色譜–同位素稀釋質(zhì)譜法測定人體生長激素＊

金有訓(xùn)，石蓮花，武利慶，王晶

（中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

建立了準(zhǔn)確、快速測定痕量人體生長激素的同位素稀釋質(zhì)譜法。選取同位素標(biāo)記脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)物，將內(nèi)標(biāo)物以重量法與待測樣品準(zhǔn)確混合，利用Kinetex C18色譜柱分離，以電噴霧三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，建立了人體生長激素的液相色譜–同位素稀釋質(zhì)譜聯(lián)用定量方法。人體生長激素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量測定結(jié)果為(1.82±0.04) mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%（n=6）。該方法簡易、實(shí)用、準(zhǔn)確、可靠，可作為人體生長激素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法，并為人體生長激素的日常檢測提供參考。

人體生長激素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；液相色譜法；同位素稀釋質(zhì)譜法；定量

人體生長激素（hGH）是人體自身分泌的、可促進(jìn)生長發(fā)育的重要肽類激素，由191種氨基酸組成，臨床應(yīng)用于生長激素缺乏的兒童矮小癥、先天性卵巢發(fā)育不全綜合癥、急性壞死性胰腺炎、燒傷、膿毒癥等病癥的治療［1–3］。早期hGH只能從尸體腦垂體中提?。?］，來源困難，價(jià)格昂貴，難以廣泛應(yīng)用。近年來隨著基因重組技術(shù)的快速發(fā)展，人們開始以重組技術(shù)生產(chǎn)hGH，hGH在臨床上的應(yīng)用逐漸擴(kuò)展，但出現(xiàn)了使用不當(dāng)或過量使用引起嚴(yán)重不良反應(yīng)的情況。2008年世界反興奮劑機(jī)構(gòu)宣布了一系列運(yùn)動(dòng)員禁用的藥物，其中就有 hGH［5–6］，因此 hGH 的準(zhǔn)確定量受到世界越來越多的關(guān)注。hGH檢測使用的試劑種類多，來源多，特別是相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏，造成檢測結(jié)果偏差較大，亟需建立高準(zhǔn)確度、高精密度的hGH測量方法。

目前，hGH的臨床檢驗(yàn)方法有免疫分析法［7–8］、液相色譜(HPLC)法［9］、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(LC–MS/MS)法［10–12］、毛細(xì)管電泳結(jié)合紫外和質(zhì)譜技術(shù)［13］。以上方法都是hGH相對(duì)測定法，操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，而且缺乏hGH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。近年來，國外一些技術(shù)機(jī)構(gòu)研制了hGH相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如韓國標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)研究院(KRISS)的hGH溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、德國聯(lián)邦物理技術(shù)研究院(PTB)的人血清基質(zhì)hGH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而我國hGH相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尚為空白。

筆者采用國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)（JCTLM）認(rèn)可的同位素稀釋技術(shù)［14–15］，結(jié)合液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立hGH純品蛋白質(zhì)含量絕對(duì)測量的LC–IDMS/MS法，并對(duì)其測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定。此項(xiàng)研究在建立我國hGH量值溯源傳遞體系，保證臨床檢驗(yàn)中hGH測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性等方面具有重要的意義，也可為建立相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent1200/API5500型，美國安捷倫科技有限公司/美國AB公司；

分析天平：ME235S型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯集團(tuán)；

混合器：VORTEX GENIE 2型，美國Scientific Industries公司；

移液 器：10～100 μL，20～200 μL，100～1 000 μL，0.5～5 mL，德國 Eppendorf公司；

氮吹儀：N–EVAP112型，美國OA–SYS公司；

離心機(jī)：RC10–22T型，美國Thermo公司；

過濾膜：0.22 μm，親水性聚丙烯膜，美國Pall公司；

氨基酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(1)脯氨酸，編號(hào)為GBW(E) 100084，純度為99.5%，(2)纈氨酸，編號(hào)為GBW(E) 100055，純度為99.3%，(3)苯丙氨酸，編號(hào)為GBW(E) 100061，純度為99.9%，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

氨基酸同位素標(biāo)記物：(1)13C5-脯氨酸，純度為99%，(2)13C5-纈氨酸，純度為99%，(3)13C9-苯丙氨酸，純度為98%，美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；

hGH樣品：每瓶1 mL，于–70℃冰箱中保存，韓國標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)研究院（KRISS）；

三氟乙酸：色譜純，北京迪科馬科技有限公司；

鹽酸：優(yōu)級(jí)純，北京化學(xué)試劑公司；

乙腈：色譜純，美國J. T. Baker公司；

甲酸：色譜純，美國Sigma公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由美國Mililpore公司超純水儀制得。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜

色 譜 柱：Kinetex C18柱 (150 mm×2 mm，2.6μm，美國菲羅門公司)；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：3μL；流量：0.2 mL/min；分析時(shí)間：5 min。

1.2.2 質(zhì)譜

采用電噴霧離子源(ESI)、正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；噴霧電壓：5.0 kV；殼氣壓力：2 MPa；輔助氣壓力：0.5 MPa；干燥氣溫度：550℃；碰撞能量：25 eV；監(jiān)測離子：脯氨酸為m/z116→70，13C5-脯氨酸為m/z121→74，纈氨酸為m/z118→72，13C5-纈氨酸為m/z123→76，苯丙氨酸為m/z166→120，13C9-苯丙氨酸為m/z175→128。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

hGH樣品共6支，每支約裝有1 mL hGH，保存于–70℃冰箱中，測定時(shí)每支樣品取1 mL，進(jìn)行前處理。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品前處理

分別準(zhǔn)確稱取一定量纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，各用1%甲酸水溶液稀釋并配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用混合器漩渦10 min，充分溶解。再各取一定量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用1%甲酸水溶液稀釋至10倍體積，制得纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。同樣步驟制備13C5-纈氨酸、13C5-脯氨酸、13C9-苯丙氨酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

使用各氨基酸及同位素標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制與樣品中各待測氨基酸含量接近（約1∶1）的同位素標(biāo)記與非標(biāo)記氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜（LC–MS/MS）分析。

精確稱取1 mg hGH，溶于1 mL純水，配制成1 mg/mL hGH標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm濾膜過濾，取50μL 濾液于2 mL安瓿瓶中，加入同位素標(biāo)記氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使氨基酸與相應(yīng)同位素標(biāo)記的氨基酸質(zhì)量比接近于1∶1。充分混合后，真空離心干燥30 min，加入 6 mol/L 鹽酸 500 μL，通氮除氧后密封，于110℃烘箱中進(jìn)行水解。水解后用氮?dú)獯蹈?，?00 μL 0.1%鹽酸溶液復(fù)溶，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行LC–MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 hGH純品蛋白質(zhì)酸水解

目前，hGH尚無相應(yīng)的蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記物，因此利用蛋白質(zhì)的酸水解方法使hGH獲得游離氨基酸，基于氨基酸結(jié)合同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)hGH蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。鹽酸是蛋白質(zhì)水解的常用酸，蛋白質(zhì)水解受溫度、鹽酸的濃度、水解時(shí)間等影響，是蛋白質(zhì)定量中的關(guān)鍵步驟。為了使hGH完全水解成游離氨基酸，分別于110℃高溫下水解12，24，48，72，96 h，并選擇在酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定的脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸作為待測氨基酸，確定最佳的水解時(shí)間。結(jié)果表明，水解48 h后，3種氨基酸的相對(duì)比例都達(dá)到較穩(wěn)定的平臺(tái)期［16］。

2.2 hGH純品蛋白質(zhì)在LC–IDMS上的分離

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和hGH純品蛋白質(zhì)水解樣品在液相色譜–同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜上的分離情況如圖1所示。圖1(a)為3種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的LC–MS/MS分離色譜圖，圖1(b)為hGH純品蛋白質(zhì)檢測樣品的LC–MS/MS分離色譜圖。從圖中可以看出5 min之內(nèi)可以快速分離3種氨基酸，脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸的保留時(shí)間分別為1.61，1.93和3.68 min。在hGH純品蛋白質(zhì)樣品的色譜圖中還檢測出異亮氨酸和亮氨酸，其分離度和測量重復(fù)性良好。美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）檢測5種氨基酸需要25 min［17］，而此方法在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離，節(jié)約了分析時(shí)間。

圖1 氨基酸多反應(yīng)檢測模式色譜圖

2.3 結(jié)果計(jì)算

用同位素稀釋單點(diǎn)校準(zhǔn)法計(jì)算樣品中氨基酸的含量，計(jì)算公式為式(1)：

式中：C——樣品中氨基酸的含量，mg/g；

Cstd——標(biāo)準(zhǔn)溶液中氨基酸的含量，mg/g；

Mstd——標(biāo)準(zhǔn)溶液中氨基酸的質(zhì)量，mg；

Isample——樣品溶液中氨基酸與同位素標(biāo)記物的色譜峰面積比值；

Mis-spiked——樣品溶液中加入同位素標(biāo)記物的質(zhì)量，mg；

Mis-std——標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入同位素標(biāo)記物的質(zhì)量，mg；

Istd——標(biāo)準(zhǔn)溶液中氨基酸與同位素標(biāo)記物的色譜峰面積比；

Wsample——樣品質(zhì)量，mg。

根據(jù)計(jì)算所得氨基酸的含量，轉(zhuǎn)換后得出hGH蛋白質(zhì)的濃度。

2.4 hGH純品蛋白質(zhì)的定量結(jié)果

利用IDMS方法測定氨基酸含量，然后間接確定hGH蛋白質(zhì)的含量。使用單點(diǎn)法測定，從樣品中分別取6份子樣進(jìn)行同位素稀釋質(zhì)譜法測定，每進(jìn)一次標(biāo)準(zhǔn)樣品，再進(jìn)一次樣品，每瓶水解樣品測定3次，hGH蛋白質(zhì)含量的定量結(jié)果列于表1。

表1 LC–IDMS法對(duì)hGH蛋白質(zhì)的測定結(jié)果

由表1可知，LC–IDMS法的重復(fù)性好，hGH蛋白質(zhì)濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%。利用同位素稀釋質(zhì)譜法測定hGH蛋白質(zhì)含量，測定結(jié)果在KRISS hGH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果［(1.76±0.25) mg/g］不確定度范圍內(nèi)，表明利用本方法測定高豐度、高穩(wěn)定性的氨基酸，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行間接定量，精密度、再現(xiàn)性良好。

3 結(jié)語

建立了hGH純度的LC–IDMS測定方法。所建立的LC–IDMS方法溯源清晰，準(zhǔn)確度高，可作為hGH溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值技術(shù)，為hGH相關(guān)基質(zhì)蛋白及其它基體蛋白的定量提供新的思路和手段。并可用于其它內(nèi)分泌肽類和蛋白類激素的準(zhǔn)確定量，為疾病診斷標(biāo)志物肽類和蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確定量方法研究和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制奠定基礎(chǔ)。

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我國環(huán)保監(jiān)測行業(yè)發(fā)展趨勢及前景預(yù)測分析

環(huán)境監(jiān)測是整個(gè)環(huán)保行業(yè)的基礎(chǔ)。如果沒有監(jiān)測，就沒有辦法對(duì)水、氣、土進(jìn)行檢測，無法評(píng)估環(huán)境防治效果以及監(jiān)督污染源的整治。同時(shí)，國家如果想更好地掌握環(huán)境信息，就必須依靠自己所建設(shè)的環(huán)境監(jiān)測網(wǎng)，為此國家重點(diǎn)打造自身的環(huán)境監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)?！笆濉逼陂g國控監(jiān)測網(wǎng)體系已經(jīng)基本搭建完成，“十三五”的主要任務(wù)是進(jìn)一步完善整個(gè)監(jiān)測網(wǎng)體系，并且逐步向省市一級(jí)的監(jiān)測網(wǎng)下沉。長遠(yuǎn)來看，監(jiān)測網(wǎng)體系將會(huì)遍布行業(yè)各個(gè)環(huán)節(jié)。

環(huán)境監(jiān)測分環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測和污染源監(jiān)測。環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測主要是考核環(huán)境保護(hù)成果以及環(huán)境質(zhì)量，監(jiān)測對(duì)象有大氣、水、土壤和噪聲監(jiān)測。污染源監(jiān)測主要是控制有害物質(zhì)的排放量，監(jiān)測對(duì)象有廢污水、廢氣以及重金屬。

環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測中，大氣監(jiān)測主要由國控點(diǎn)(以地級(jí)以上行政單位為主)開始逐漸下沉到省控點(diǎn)(以縣級(jí)行政單位為主)以及農(nóng)村空氣監(jiān)測。水質(zhì)監(jiān)測分地表水監(jiān)測和地下水監(jiān)測：其中地表水監(jiān)測包括各大江河湖海、集中式水源地、近海海域等。主要由國家地表水質(zhì)監(jiān)測斷面為主。地下水污染監(jiān)測體系需要結(jié)合之前國土資源、水利工程等已有的地下水工程。土壤監(jiān)測方式主要為土壤采樣、實(shí)驗(yàn)室分析為主，環(huán)保部印發(fā)多篇文件規(guī)范土壤監(jiān)測方法與技術(shù)。污染源監(jiān)測中，廢(污)水主要來自于生活污水和工業(yè)污水排放。廢氣監(jiān)測以前主要是CEMS系統(tǒng)監(jiān)測，后來增加了針對(duì)有機(jī)污染物的VOCs監(jiān)測。主要來自工業(yè)廢氣排放企業(yè)的監(jiān)測和布點(diǎn)。重金屬的排放主要通過工業(yè)廢水廢氣廢渣的方法排放，因此重金屬監(jiān)測和現(xiàn)有的工業(yè)廢(污)水、廢氣監(jiān)測是緊密聯(lián)系的。

“十二五”以及“十三五”期間，各項(xiàng)國家政策推動(dòng)監(jiān)測行業(yè)快速發(fā)展。但是在整個(gè)環(huán)保行業(yè)中，監(jiān)測行業(yè)中監(jiān)測的市場體量依舊比較小，還具有很大的發(fā)展空間。根據(jù)國家環(huán)境監(jiān)測總站的數(shù)據(jù)，監(jiān)測行業(yè)銷售額從2011年的108億上升到了2015年227億，年復(fù)合增長率約16%。

目前全國從事環(huán)境監(jiān)測業(yè)務(wù)的企業(yè)共有約200家，大部分企業(yè)從事廢氣、廢水、環(huán)境空氣、地表水等在線自動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)的研制、生產(chǎn)、安裝、運(yùn)營(含集成商)。其中，約有120家企業(yè)生產(chǎn)廢氣在線監(jiān)測系統(tǒng)，約有80家企業(yè)生產(chǎn)廢水在線監(jiān)測系統(tǒng)。

截至2015年底，共建成全國環(huán)境空氣質(zhì)量監(jiān)測點(diǎn)3 360個(gè)，其中“國控點(diǎn)”1 436個(gè)。根據(jù)《全國農(nóng)村環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測工作實(shí)施方案》，2017～2019年新增1 695個(gè)村莊的環(huán)境監(jiān)測站，2020年之后新增5 000余個(gè)村莊的環(huán)境監(jiān)測工作站。

（中國分析計(jì)量網(wǎng)）

Quantification of Human Growth Hormone by Liquid Chromatography–Isotope Dilution Mass Spectrometry

Jin Youxun, Shi Lianhua, Wu Liqing, Wang Jing
(National Institute of Metrology, Beijing 100013, China)

The method for determining human growth hormone (hGH) by liquid chromatography–isotope dilution mass spectrometry (LC–IDMS) was developed. The isotope labeled proline, valine and phenylalanine were added into the hGH samples as internal standard. The samples were separated by Kinetex C18column, and detected by tandem mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source used in multiple reaction monitoring mode(MRM). The content of hGH was (1.82±0.04) mg/g with RSD of 0.43% (n=6). The developed method is simple, practical, accurate,reliable, and reproducible, it is able to be applied for the development of pure hGH certified reference material (CRM) and to provide reference for the routine detection of hGH.

certified reference material of human growth hormone solution; liquid chromatography; isotope dilution mass spectrometry; quantitation

O657.7

A

1008–6145(2017)05–0012–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.003

*技改量傳項(xiàng)目(32-ALC1518-JY)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0500800)

聯(lián)系人：金有訓(xùn)；E-mail: jinyx@nim.ac.cn

2017–06–08