山楂多糖的成分測(cè)定及其單糖組分分析研究

鄧旭坤，江善青，穆 俊，段 歡，舒廣文，陳旅翼

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

山楂多糖的成分測(cè)定及其單糖組分分析研究

鄧旭坤，江善青，穆 俊，段 歡，舒廣文，陳旅翼

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

目的：研究山楂多糖的總多糖含量及單糖組分構(gòu)成. 方法：用苯酚-硫酸法測(cè)定山楂多糖中的中性多糖含量，用間羥基聯(lián)苯法測(cè)山楂多糖中糖醛酸含量，用紅外光譜法初步探究山楂多糖官能團(tuán)，用氣相色譜法分析山楂多糖中單糖組分. 結(jié)果：山楂多糖中中性多糖的含量為72.00%；糖醛酸的含量為14.98%；紅外光譜分析表明山楂多糖可能為一種氨基多糖；氣相色譜法分析得山楂多糖的單糖組成為木糖、核糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、葡萄糖、半乳糖，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.53%、13.85%、14.26%、9.29%、8.37%、19.91%、21.93%. 結(jié)論：該方法比較便捷，重復(fù)性好，可用于山楂多糖中單糖的組成成分分析.

山楂多糖；含量測(cè)定；組分分析

AbstractObjective:To study the total content of polysaccharide in hawthorn and its monosaccharide components. Methods : The content of neutral polysaccharide in hawthorn polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method, the content of uronic acid in polysaccharides was determined bym-hydroxydiphenyl method, the functional group of the polysaccharide was preliminarily explored by FT-IR, and the monosaccharide components were analyzed by GC. Results: The content of neutral polysaccharide in hawthorn polysaccharide was 72.00%, and the content of uronic acid was 14.98%. FT-IR indicated that polysaccharide in hawthorn was probably a amino-polysaccharide. GC showed that the monosaccharide components of polysaccharide in hawthornincluded xylose, ribose, arabinose, rhamnose, fructose, glucose and galactose, whose mass fraction were 9.29%, 13.85%, 14.26%, 5.53%, 8.37%, 19.91% and 21.93%,respectively. Conclusion: These methods are convenient and fast with good repeatability, which can be applied to component analysis of monosaccharide for polysaccharide in hawthorn.

Keywordspolysaccharide in hawthorn ; content determination; component analysis

山楂為薔薇科植物山楂或山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)干燥成熟果實(shí)，味酸、甘，微溫，歸肝、胃、脾經(jīng)，具有消食健胃、化濁降脂、行氣散瘀的功效.山楂作為藥食同源的常見(jiàn)中藥之一，日常應(yīng)用廣泛[1].目前臨床上主要用于心腦血管系統(tǒng)疾病及消化系統(tǒng)疾病，也是常用的減肥藥和輔助降血脂原料之一.植物多糖是天然有機(jī)化合物中的大分子物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與衰老、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、控制細(xì)胞分裂和分化等多方面的功能, 同時(shí)一些炎癥反應(yīng)、受體識(shí)別和免疫反應(yīng)等都與多糖分子密切相關(guān)[2,3].作為山楂藥材含量較高的活性成分之一的多糖，其含量檢測(cè)和單糖組成的研究對(duì)于山楂藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)非常重要.另外，如何獲得產(chǎn)量高和高純度大的竹節(jié)參多糖也是研究的主要目標(biāo)，本文對(duì)山楂多糖的提取、分離、純化及其所總多糖含量和單糖組分進(jìn)行了初步探究，以期為山楂的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

山楂購(gòu)自山東省沂蒙市，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬(wàn)定榮教授鑒定為薔薇科植物山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)干燥成熟果實(shí).三氟乙酸(批號(hào)20120903)、鹽酸羥胺(批號(hào)20120510)、葡萄糖(批號(hào)20130306)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿拉伯糖(批號(hào)20121013)、D-半乳糖(批號(hào)20121208)、阿洛糖(批號(hào)20121109)、果糖(批號(hào)20121213)均購(gòu)自合肥BIOSHARP生物科技公司；D-核糖(批號(hào)20120911)、木糖(批號(hào)20120317)、鼠李糖(批號(hào)20121010)均購(gòu)自阿拉丁試劑股份有限公司，其他常規(guī)試劑均為分析純.

紫外分光光度計(jì)(ZF-6型，上海嘉鵬科技公司)，傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet-6700，美國(guó)Thermo Fisher)，氣相色譜儀(Agilent Technologies-6890N，檢測(cè)器：FID)，色譜柱(Agilent19091N-113 HP-INNOWax Polyethyene Glycol 30.0 m×320 μm×0.25 μm).透析袋(BIOSHARP，截留分子量為7000 ～14000).

1.2山楂多糖的提取、分離及純化

取山楂藥材，干燥，粉碎，取粉末100 g(全部能通過(guò)2號(hào)篩，不能通過(guò)3號(hào)篩)，95%乙醇60℃回流3 h，脫脂；80%乙醇60℃回流2 h，脫單糖和低聚糖；過(guò)濾，藥渣烘干(不高于50℃)，加入純化水(1︰25，w/v)，80℃提取3次，每次3 h，過(guò)濾，合并濾液，再濃縮至一定體積，加入乙醇，使溶液的乙醇濃度達(dá)約80%，4℃放置12 h.過(guò)濾，得到的沉淀物烘干，即得粗多糖.

取所得粗多糖，加適量熱水溶解，進(jìn)行流水透析48 h；取透析液，真空冷凍干燥，得精多糖[4].

1.3山楂多糖的中性多糖含量測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取一定量的葡萄糖(分析純)，105℃下干燥1 h，于干燥器中30 min，使之冷卻.然后精密稱(chēng)定10 mg葡萄糖，蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)液.分別精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，各補(bǔ)水至2 mL.加入6%苯酚1 mL，振蕩，再加入6 mL的95 %的濃硫酸，搖勻，于40℃水浴30 min.取出冷卻至室溫.在490 nm處檢測(cè)其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).再進(jìn)行精密度，穩(wěn)定性考察，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)[5-8].

1.3.2 供試品含量測(cè)定

精密稱(chēng)定山楂多糖樣品10 mg，測(cè)定方法同 “1.3.1”.

1.4山楂多糖的糖醛酸含量測(cè)定

1.4.1 間羥基聯(lián)苯溶液的配制

精密稱(chēng)取NaOH 0.5 g，溶解后定容至100.00 mL，得0.5% NaOH溶液；稱(chēng)取7.5 mg間羥基聯(lián)苯，用5 mL 0.5% NaOH溶解，即可配成0.15%的間羥基聯(lián)苯.

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱(chēng)取4 mg葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后定容至50.00 mL，即,得到80 μg/m L的對(duì)照品溶液.

1.4.3 四硼酸鈉-硫酸溶液的配制

精密稱(chēng)取四硼酸鈉0.475 g，溶解后定容至100.00 mL，即得0.0125 mol/L的四硼酸鈉-硫酸溶液.

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mL于刻度試管中，加蒸餾水至0.5 mL，搖勻，置于冰水浴中加入 0.0125 mol/L 的四硼酸鈉-硫酸溶液2.5 mL，震搖，再置于沸水浴中加熱5 min，而后迅速冷卻至室溫，再加0.15%的間羥基聯(lián)苯溶液50 μL，以加入標(biāo)準(zhǔn)品0 mL的試管作為空白，在525 nm的波長(zhǎng)處，用紫外分光光度法測(cè)其吸光度，20 min內(nèi)測(cè)定完成，以葡萄糖醛酸對(duì)應(yīng)的吸光度，計(jì)算回歸方程[9,10].

1.4.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按法分別連續(xù)測(cè)定6 次吸光度，計(jì)算RSD值.

1.4.6 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品，每隔10 min測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值.

1.4.7 重復(fù)性考察

取同一份供試品，在525 nm處測(cè)吸光度，連續(xù)測(cè)6次，計(jì)算RSD值.

1.4.8 供試品溶液含量測(cè)定

精密稱(chēng)定山楂多糖樣品10 mg，供試品溶液含量測(cè)定方法同“1.4.4”.

1.5山楂多糖官能團(tuán)分析

取光譜純KBr少許，置于160℃環(huán)境下6 h使烘干，而后置于干燥器中，備用.采用KBr壓片法，取精制多糖2.0 mg，KBr 150.0 mg，研缽研細(xì)，以KBr空白片作對(duì)照組，在4000～400 cm-1區(qū)間掃描，觀察譜峰情況[11].

1.6山楂多糖中單糖組分分析

1.6.1 單糖對(duì)照品衍生化

精密稱(chēng)定鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、阿洛糖、半乳糖、甘露糖、肌醇10種單糖對(duì)照品各10 mg于試管中，各加入鹽酸羥胺12 mg和吡啶0.5 mL，置于電熱干燥箱中，90℃環(huán)境下反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，之后加入0.5 mL醋酐，90℃反應(yīng)30 min，氮?dú)獯蹈珊?，?.0 mL氯仿溶解，備用[12-14].

1.6.2 山楂多糖水解

精密稱(chēng)定山楂多糖10 mg置安瓿瓶中，加入10 mL 3 mol/mL三氟乙酸，置于電熱干燥箱中，120℃水解6 h，室溫冷卻后用氮?dú)獯蹈桑脝翁?，置于干燥器中保存?zhèn)溆?

1.6.3 山楂多糖供試品制備

取多糖水解后的單糖樣品按“1.6.2”法.

1.6.4 空白容液供試品的制備

空白溶液處理方法亦如上.

1.6.5 氣相色譜條件

載氣：氮?dú)?純度99.999%)，氫氣流量50.0 mL/min ；空氣流量400 mL/min，氮?dú)獯滴擦髁?0.0 mL/min，恒定壓力8.79 psi，平均線(xiàn)速度34 cm/s；氣化室溫度為240℃，檢測(cè)器溫度為260℃，色譜柱初溫為140℃，維持3 min，以10℃/min升至240℃，保持11 min，分流比為20︰1，進(jìn)樣量為1 μL.

2 結(jié)果

2.1山楂多糖中總多糖含量

用苯酚-硫酸法測(cè)山楂多糖中的中性多糖含量，用葡萄糖為對(duì)照品，以吸光度對(duì)濃度作圖，得到山楂多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=0.416X+1.829，R2=0.9940(n=6)，線(xiàn)性范圍為0.02～0.14 mg/mL.經(jīng)計(jì)算得山楂多糖中總多糖含量為72.00%.精密度試驗(yàn)的RSD值為1.37%；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明供試品在120 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為1.86%；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為1.61%.

2.2山楂多糖中總多糖糖醛酸含量

用間羥基聯(lián)苯法測(cè)得糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=1.2966X+0.0239，R2=0.9942(n=6)，線(xiàn)性范圍為0.010～0.050 mg/mL.經(jīng)計(jì)算得到糖醛酸多糖含量為14.98%.精密度試驗(yàn)的RSD值為1.64%；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明供試品在120 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為1.93%；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為1.73%.

2.3山楂多糖官能團(tuán)分析

用紅外光譜分析山楂多糖的組成成分, 由圖1可以看出，在3600～3200、3200～2800、1400～1200、1100～1000 cm-1這4個(gè)紅外光譜區(qū)間內(nèi)都出現(xiàn)了典型多糖物質(zhì)的吸收峰.在2947.6 cm-1處明顯的吸收峰可以推測(cè)其分子結(jié)構(gòu)中甲基和亞甲基含量比較大；1629.1 cm-1處的吸收峰可能是乙?；孽０坊鶊F(tuán)，由于存在酰胺基團(tuán), 提示其可能為一種氨基多糖；1150.2 cm-1處的吸收峰可能是C—O—H和吡喃糖環(huán)的C—O—C.

σ/cm-1圖1 山楂多糖組分的紅外光譜分析Fig.1 Infrared spectrum analysis of polysaccharides in Hawthorn

2.4山楂多糖組分分析

單糖的成分組成可以根據(jù)出峰時(shí)間確定，各個(gè)單糖的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以通過(guò)峰面積歸一化法求得.在實(shí)驗(yàn)確定的色譜條件下，將10種對(duì)照品的單糖衍生物單獨(dú)進(jìn)樣，依次記錄各個(gè)單糖樣品的保留時(shí)間，再將10種對(duì)照品混合后再衍生化所得的溶液進(jìn)樣，確認(rèn)各單糖衍生物的峰位置，最后將供試品溶液和空白溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖2(見(jiàn)圖a和b).圖a中單糖樣品色譜峰的保留時(shí)間鼠李糖(12.85 min)，核糖(13.69 min)，阿拉伯糖(14.48 min)，木糖(15.00 min)，果糖(16.16 min)，甘露糖(17.69 min)，阿洛糖(19.89 min)，肌醇(21.27 min)，葡萄糖(21.70 min)，半乳糖(21.90 min).圖b中多糖山楂的圖譜中出現(xiàn)了鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖這7個(gè)吸收峰，它們的保留時(shí)間分別為12.85, 13.69, 14.48, 15.00, 16.16, 21.70, 21.90 min.通過(guò)面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算多糖成分中各單糖的組分，單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見(jiàn)表1.

1) 鼠李糖；2) 核糖；3) 阿拉伯糖；4) 木糖；5) 果糖；6) 甘露糖；7) 阿洛糖；8) 肌醇；9) 葡萄糖；10) 半乳糖圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品(a)和山楂多糖供試品(b)的GC色譜圖Fig.2 GC chromatograms of mixed monosaccharide standards (a)and polysaccharide samples (b)

Tab.1 Monosoccharide composition and mass fractions of polysaccharide in Hawthorn.

單糖組分出峰時(shí)間t/min質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%鼠李糖12.859.29核糖13.6913.85阿拉伯糖14.4814.26木糖15.005.53果糖16.168.37葡萄糖21.7019.91半乳糖21.9021.93

3 討論

山楂是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源中藥,不僅有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,還有廣泛的藥理作用.山楂多糖是其重要的生物活性物質(zhì),具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤以及降血脂的藥理作用[15].閆啟光研究發(fā)現(xiàn)山楂能增強(qiáng)小鼠的免疫力[16].李剛等[17]研究發(fā)現(xiàn)山楂活性多糖還具有抗腫瘤作用.山楂多糖在藥用和保健食品的開(kāi)發(fā)潛力巨大，利用前景非常樂(lè)觀[18]，因此，對(duì)山楂中多糖成分的含量及其單糖組成的檢測(cè)，對(duì)于山楂的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制意義重大 .

本文在提取山楂多糖時(shí)溫度控制在60℃以下，有利于保護(hù)其中對(duì)熱不穩(wěn)定的成分，使其不容易水解.采用95%的乙醇脫脂溶性成分，流水透析進(jìn)一步純化.本文嘗試采取苯酚-硫酸法測(cè)定其中性多糖的含量，聯(lián)合運(yùn)用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定山楂多糖中糖醛酸的含量，可以全面地反映出山楂多糖中總多糖含量.利用傅里葉紅外光譜技術(shù)推測(cè)出山楂多糖可能是一種氨基多糖.進(jìn)一步運(yùn)用氣相色譜法分析山楂多糖中單糖組成，參照各單糖標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果確定了山楂多糖中含有鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組分.經(jīng)計(jì)算各單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為9.29%、13.85%、14.26%、5.53%、8.37%、19.91%、21.93%.氣相圖譜中另外有約10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的雜峰，其中18.90 min處的峰較為明顯，由于沒(méi)有較明確的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，該物質(zhì)可能是其它某種單糖抑或是某種未知物質(zhì)，有待更深入的檢測(cè)分析進(jìn)行確認(rèn).

[1] 王 坦, 苗明三, 苗艷艷. 山楂的現(xiàn)代研究特點(diǎn)分析[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào), 2015, 30(5):708-710.

[2] 陳文娟, 陳建福. 血柚皮多糖的堿法提取及其抗氧化活性研究[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014, 23(3):22-27, 32.

[3] 王 建, 龔興國(guó). 多糖的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2011, 22 (1):52-55.

[4] Tong L, Ye L, Guan X, et al. Immunopontentiating and antitumor activities of a polysaccharide fromPulsatillachinensis(Bunge) Regel[J]. Int J Biol Macromol, 2013, 54(3):225-229.

[5] 朱海濤, 楚亞琴, 陳 黎. 正交試驗(yàn)優(yōu)選蒽酮-硫酸法測(cè)定白芨多糖含量條件[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2014, 34(20):1714-1718.

[6] 韋 練, 郭 力, 陳佳江, 等. 3, 5-二硝基水楊酸法測(cè)定石斛多糖含量的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2013, 24(6):1330-1332.

[7] 孫曉燕, 蔡昌利, 徐麗莉等. 多糖含量測(cè)定方法的比較[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2015(3)：58-62.

[8] 辛 敏, 劉 軒, 詹 欣,等. 硫酸-紫外法與苯酚-硫酸法測(cè)定千兩茶中總多糖的比較[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20 (3):62-65 .

[9] 陳巧巧, 萬(wàn) 琴, 王振中, 等. 人參多糖中糖醛酸含量測(cè)定方法的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012, 18(8):121-124.

[10] 王 慧, 熱娜·卡斯木, 樊珍珍. 新疆赤芍多糖中糖醛酸含量的測(cè)定[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2013, 9(2):12-14.

[11] Huang F,Zhang R,Yi Y,et al.Comparison of physicoche- mical properties and immunomodulatory activity of polysaccharides from fresh and dried litchi pulp[J]. Molecules, 2014, 19(19):3909-3925.

[12] 鄧旭坤, 吳 非, 陳旅翼, 等.氣相色譜法分析大麻藥多糖成分中單糖組成[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 34(2):48-51.

[13] Yang W, Wang Y, Li X, et al. Purification and structural characterization of Chinese yam polysaccharide and its activities[J]. Carbohydr Polym, 2015, 117:1021-1027.

[14] Jia X, Zhang C, Qiu J, et al. Purification, structural characterization and anticancer activity of the novel polysaccharides fromRhynchosiaminimaroot.[J]. Carbohydr Polym, 2015, 132:67-71.

[15] 呂玲霞, 辛立紅, 管仁偉, 等. 山楂多糖藥理作用和提取工藝研究進(jìn)展[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2016, 39(6):1081-1085.

[16] 閆啟光. 山楂多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥咨訊, 2009(6) : 134.

[17] 李 剛, 梁新紅, 葛曉虹. 山楂化學(xué)成分及其保健功能特性[J]. 江蘇調(diào)味副食品, 2009, 26(6): 25-27, 30.

[18] 劉家蘭, 徐曉玉. 山楂的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2009(S1):63-66.

ContentDeterminationofPolysaccharideinHawthornandComponentAnalysisofItsMonosaccharide

DengXukun,JiangShanqing,MuJun,DuanHuan，ShuGuangwen,ChenLüyi

(College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

O657.71; TQ464

A

1672-4321(2017)03-0052-05

2017-02-20

鄧旭坤(1972-)，男，教授，博士，研究方向：藥理學(xué)，中藥炮制學(xué)，E-mail：dengxukun@mail.scuec.edu.cn

國(guó)家科技部“十二五”科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAI27B06)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81073147)