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    降脂藥物篩選方法的研究進展

    2017-10-18 01:07:02陳雪嬌
    關(guān)鍵詞:降脂藥高脂高脂血癥

    紀 旭,陳雪嬌,2,*,羅 丹,2,李 潔

    (1 中國科學(xué)院 昆明植物研究所,植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室,昆明 650201;2 中國科學(xué)院大學(xué) 存濟醫(yī)學(xué)院,北京 101407)

    降脂藥物篩選方法的研究進展

    紀 旭1,陳雪嬌1,2,*,羅 丹1,2,李 潔1

    (1 中國科學(xué)院 昆明植物研究所,植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室,昆明 650201;2 中國科學(xué)院大學(xué) 存濟醫(yī)學(xué)院,北京 101407)

    指出了高脂血癥是心腦血管疾病的主要危害因素之一,容易誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等多種疾病,嚴重威脅人類健康. 通過文獻調(diào)研,對近年來國內(nèi)外降血脂藥物的作用靶點和篩選方法進行了綜述,為降血脂活性成分的篩選研究提供參考.

    高脂血癥;藥用靶點;篩選方法

    AbstractHyperlipidemia is one of the main risk factors of cardiovascular and cerebrovascular disease, and it may trigger serious diseases, such as atherosclerosis, coronary heart disease and stroke etc., which represent a substantial global threat to human health. In this review, the pharmacological targets and screening methods of hypolipidemic drugs developed in recent years have been reviewed, which will provide references for further research of hypolipidemic drugs.

    Keywordshyperlipidemia ; pharmacological targets ; screening methods

    1 降脂藥物篩選方法建立的背景及意義

    隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,高脂血癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]. 高脂血癥是體內(nèi)脂類代謝紊亂導(dǎo)致血脂水平增高的一種疾病,是指各種原因?qū)е碌难獫{中膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)升高、和(或)高密度脂蛋白(HDL)降低的一種全身脂代謝異常疾病[2]. 高脂血癥是心腦血管疾病的主要危害因素之一,容易誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中等多種心腦血管疾病. 最近,有研究顯示高脂血癥對認知障礙也有影響. 高脂血癥已經(jīng)嚴重威脅著人類的健康[3].

    現(xiàn)在臨床常用的降血脂藥物,療效低且常伴有一定副作用. 因此,尋找更加安全、有效的降脂藥物一直是醫(yī)藥工作者的研究熱點. 對于新藥物的研究,合適的藥物作用靶點和篩選方法顯得至關(guān)重要,不僅有助于縮短藥物的研發(fā)時間,也能節(jié)約人力物力資源. 本文將對目前已上市或正在研發(fā)的降脂藥物及其篩選方法進行綜述,目的是幫助科研人員在了解該領(lǐng)域研究進展的基礎(chǔ)上,建立一種快速、簡便、低成本且能實現(xiàn)高內(nèi)涵、高通量篩選的藥物篩選方法.

    2 降脂藥物的主要作用靶點

    目前治療高脂血癥的藥物主要有以下幾大類:膽酸鰲合劑類(樹脂類)、煙酸及其衍生物類、多烯脂肪酸類(魚油類)、苯氧芳酸類(貝特類)和羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑類(他汀類)[4]. 雖然這些藥物降脂效果明顯,但長期服用具有較大的毒副作用. 因此,國內(nèi)外越來越重視對中藥降脂作用的研究. 近年來,用中藥治療高脂血癥已成為該領(lǐng)域研究的熱點,很多中藥被證實具有很好的降脂作用,如:山楂、絞股藍、人參、大黃、何首烏、決明子、澤瀉、丹參及大豆等[5]. 此外,還有一些新靶點和作用機制的藥物,如微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑、?;o酶A-膽固醇?;D(zhuǎn)移酶抑制劑等. 表1是目前已有的和正在研發(fā)的降脂藥物及其作用靶點.

    表1 已有和正在研發(fā)的降脂藥物及其作用靶點

    3 目前已建立的降脂藥物篩選方法

    對于降血脂功效成分的篩選和降血脂藥物研發(fā),國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進行了廣泛的研究和探討. 本文將從分子水平、細胞水平和整體動物水平對已有的降脂藥物篩選方法進行劃分.

    3.1基于分子水平的篩選方法

    基于分子水平的篩選方法就是以相關(guān)酶和蛋白為藥物作用靶點,尋找其抑制劑. 目前研究較多的參與脂質(zhì)代謝的酶與蛋白質(zhì)主要有:脂蛋白脂肪酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇?;D(zhuǎn)移酶、羥甲基戊二酰輔酶 A (HMG-CoA)還原酶、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白等[34].

    HMG-CoA還原酶是膽固醇生物合成的限速酶,也是目前最主要的高血脂癥臨床藥物的作用靶點. 對HMG-CoA還原酶抑制劑的研究主要有以下4種方法: (1)分光光度法.采用分光光度法,李鵬等[35]比較了國產(chǎn)降血脂藥血脂康與洛伐他汀、辛伐他汀對 HMG-CoA還原酶的抑制作用. 結(jié)果表明,分光光度法于波長 339 nm處測定 NADPH 光吸收的下降可代表酶活力大小及反應(yīng)速度. (2)同位素標(biāo)記法.如以[14C]- 乙酸、D,L -[14C]HMG-CoA、 D,L -[14C]甲羥戊酸等同位素標(biāo)記的合成前體作為反應(yīng)底物,反應(yīng)后測定形成的固醇中同位素的摻入率,樣品抑制固醇脂質(zhì)合成能力可以通過與對照組數(shù)據(jù)對比求得[36]. (3)薄層色譜法.胡海峰等[37]建立了體外酶反應(yīng)系統(tǒng),采用薄層色譜法分析膽固醇的合成量,篩選真菌次級代謝產(chǎn)物. (4)液相色譜法.吳瓊等[38]利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS /MS) 檢測酶促反應(yīng)體系中NADPH濃度變化,建立了快速篩選HMG-CoA還原酶抑制劑的方法.

    脂肪酶是催化體內(nèi)甘油三酯水解的關(guān)鍵酶,能將血液脂蛋白中的甘油三酯水解成游離脂肪酸,脂肪酶抑制劑篩選已成為降血脂藥物研究的重要方向. 目前,脂肪酶抑制劑的篩選方法主要包括:(1)均相溶液酶法.將游離酶和底物以及酶抑制劑共同孵育, 通過檢測溶液酶的活性,來評估抑制劑對酶的抑制效果[39]. Nakai 等[40]選擇4-甲基傘形酮油酸酯作為底物,將酶與底物孵育后,通過熒光檢測的方法評估待測物對脂肪酶的抑制活性. (2)固定化酶法.將酶固定在某種合適的載體上,利用酶與抑制劑之間的親和作用,篩選具有酶抑制活性的化合物[41]. 陳錐等[42]采用磁珠收集與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS) 結(jié)合的方法從枳殼提取物中篩選潛在的脂肪酶抑制劑. 近年來,基于薄層色譜的生物自顯影方法被發(fā)展用于脂肪酶抑制劑的篩選,在最新研究中,以β-萘酚為底物和固藍B鹽(FBB)為指示劑來提高該方法檢測的靈敏度和特異性[43].

    3.2基于細胞水平的篩選方法

    基于細胞水平的篩選方法是以各種細胞為研究材料,在活細胞自然條件下研究藥物對生命體功能的影響。目前根據(jù)不同的降脂途徑,可將基于細胞水平的篩選方法分為兩大類:一類方法與受體相關(guān),另一類方法與膽固醇代謝相關(guān).

    3.2.1 與受體相關(guān)的細胞模型

    目前研究較多的受體主要是低密度脂蛋白受體(LDLR)和過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR). 唐建華等[44]構(gòu)建了“LDLR/Luc報告基因系統(tǒng)”的細胞篩選模型,并應(yīng)用該模型對500 余種中藥提取物進行了篩選,決明子、澤瀉、穿龍薯蕷等提取物顯示陽性, 與過去報道采用動物模型研究的結(jié)果一致. 馬晶晶等[45]構(gòu)建了一種人過氧化物酶體增殖物激活受體 α(hPPARα) 配體藥物篩選細胞模型,采用hPPARα 轉(zhuǎn)基因結(jié)合熒光素酶報告基因原理,將重組質(zhì)粒 phPPARα-IRES2-EGFP、報告質(zhì)粒 ptk-PPRE×3-luc 共轉(zhuǎn)染 293T 細胞,人工模擬 hPPARα 信號通路,并用貝特類降脂藥對建立的藥物篩選細胞模型進行了應(yīng)用能力評價.

    3.2.2 與膽固醇代謝相關(guān)的細胞模型

    從目前的研究來看,與膽固醇代謝相關(guān)的細胞模型可歸納為兩大類:一類將藥物直接作用于細胞,檢測相關(guān)指標(biāo)來評價藥物的作用;另一類通過建立高脂細胞模型篩選藥物. 第一類方法常選用3T3-L1 脂肪細胞、血管平滑肌細胞源性荷脂細胞和Caco-2細胞等為模型,不同濃度的待測物直接作用于細胞,通過檢測細胞內(nèi)膽固醇的含量來評價待測物的降脂活性,采用的檢測方法有高效液相色譜法、同位素標(biāo)記法和膽固醇氧化酶終點法等[46-48]. 對于高脂細胞模型的建立,大多數(shù)研究通過分別加入游離脂肪酸、高濃度血清、醫(yī)用脂肪乳注射劑和氧化的低密度脂蛋白等刺激細胞建模,在建模的同時加入待測物,以細胞內(nèi)脂滴積累情況、TG和TC的水平為指標(biāo)評價待測物的降脂活性[49-52].

    3.3基于整體動物水平的篩選方法

    在國內(nèi)外的研究中,用于高血脂研究的動物有小鼠、大鼠、兔、鵪鶉、豬、猴等,在實際應(yīng)用中,小鼠、大鼠、兔等實驗動物具有比較廉價、便于飼養(yǎng)、遺傳背景明確等特點,從而應(yīng)用最為廣泛[53]. 目前,建立高脂血癥動物模型常用的方法有:高脂飼料法、高脂乳劑法、注射法等,其中高脂飼料法是最常用的造模方法. (1)高脂飼料法.謝慧臣等[54]通過喂飼高脂飼料建立高脂血癥大鼠模型,發(fā)現(xiàn)降脂合劑對血脂異常有較好的調(diào)節(jié)作用. Sutar等[55]以高脂飲食喂飼SD大鼠21 d,建立了高脂血癥大鼠模型.(2) 高脂乳劑法. 周星等[56]用兩種不同濃度脂肪乳劑以灌胃法建立大鼠高脂模型,結(jié)果表明,高濃度脂肪乳劑可以成功建立SD大鼠高脂血癥模型,低濃度脂肪乳劑不適合用于建立SD大鼠高脂血癥模型. (3)注射法.劉凱等[57]將大鼠腹腔注射 75%蛋黃乳液,24 h即可復(fù)制出高膽固醇血癥模型,與傳統(tǒng)造型方法所得到的結(jié)果相同. Schurr等通過尾靜脈注射表面活性劑TritonWR-1339來建立高脂大鼠模型,并提出注射前禁食有利于高脂方法的建立[58]. 近年來,一些研究者通過腹腔注射TritonWR-1339建立高脂大鼠模型,評估樣品降血脂的效果[59].

    4 現(xiàn)有的降脂藥物篩選方法優(yōu)缺點

    從實驗方面來看,上述篩選方法大體可以分為兩大類:體內(nèi)實驗和體外實驗. 基于分子、細胞水平的篩選方法都屬于體外實驗,具有使用耗材少、實驗周期短、能實現(xiàn)高通量篩選、且藥物作用靶點和作用機制相對明確等優(yōu)點. 但體外實驗不能模擬在體環(huán)境,無法對化合物的生物活性進行綜合評價. 而基于整體動物水平的篩選方法屬于體內(nèi)實驗,是傳統(tǒng)的篩選方法,能直接反應(yīng)藥物的治療效果、不良反應(yīng)和毒性作用. 但該方法一般實驗周期長、篩選效率低、動物成本高,且存在個體差異性,不能實現(xiàn)大規(guī)模篩選.

    此外,就篩選模式而言,可將上述篩選方法分為:分子靶點篩選和表型篩選. 基于分子水平的篩選和與受體相關(guān)的細胞模型都屬于分子靶點篩選,該方法首先確定與疾病相關(guān)的靶點,隨后開展試驗基于該靶點高通量篩選先導(dǎo)化合物,并對其進行優(yōu)化用于后期的藥物開發(fā). 而基于整體動物水平的篩選和高脂細胞模型屬于表型篩選,一般而言,一種與疾病相關(guān)的表征被發(fā)展建立篩選模型,高通量篩選得到活性先導(dǎo)化合物,之后再確定相關(guān)的分子靶點. 在過去20年,基于分子靶點的篩選方法已成為早期藥物發(fā)現(xiàn)的主要手段,相比于表型篩選有一些明顯優(yōu)點,如已知分子靶點有助于化合物的優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系的研究等. 但有研究發(fā)現(xiàn),近10年來FDA批準的小分子藥物,通過表型篩選得到的28個已超過基于分子靶點篩選得到的17個[60]. 此外,一些經(jīng)典的藥物,如:阿司匹林、鈣通道拮抗劑等都是通過早期的表型篩選發(fā)現(xiàn)的,但其作用機制和分子靶點都是在FDA批準后很長一段時間才得以確定[61, 62]. 由此可見,表型篩選仍是一種重要的篩選方法,而且隨著實驗技術(shù)的發(fā)展,目前的表型篩選已在模式動物、細胞、篩選通量等方面取得了較大的進展,將引領(lǐng)一個先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的新時代.

    5 結(jié)語

    高脂血癥引發(fā)的心腦血管類疾病是危害人類健康的三大疾病之一,尋找有效、安全的降脂藥物一直是該領(lǐng)域研究的熱點. 不同篩選途徑相互結(jié)合、多靶點綜合考慮是降血脂功效成分篩選的趨勢,同時基于降脂新機制、作用新靶點的篩選方法正在不斷地研究和完善.

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    ResearchProgressofScreeningModelsforLipidLoweringDrugs

    JiXu1,ChenXuejiao1,2,LuoDan1,2,LiJie1

    (1 State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Yunnan 650201, China;2 Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101407, China)

    Q493.5;TQ469;R965.1

    A

    1672-4321(2017)03-0043-06

    紀 旭(1979-),男,研究員,博士,研究方向:心血管藥物的篩選及其作用機制,E-mail: jixu@mail.kib.ac.cn

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81300609),云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2014FB170),中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進會科研項目,植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室自主課題(Y3728211Z1)

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