具有抗農(nóng)作物病原真菌活性鏈霉菌Iβ1菌株的篩選鑒定及其聚酮合酶基因分析

李曉華，馬婷婷，郭 佳，黃 粵，梅 楓，皮 婷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

具有抗農(nóng)作物病原真菌活性鏈霉菌Iβ1菌株的篩選鑒定及其聚酮合酶基因分析

李曉華，馬婷婷，郭 佳，黃 粵，梅 楓，皮 婷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

從土壤中篩選出一株具有抗農(nóng)作物病原真菌活性鏈霉菌，命名為Iβ1.根據(jù)生理生化特性對(duì)其進(jìn)行了鑒定及16S rRNA基因序列同源性比對(duì)，分析了該菌株的發(fā)酵濾液抑菌穩(wěn)定性和聚酮合酶基因.結(jié)果表明: 該菌株初步鑒定為鏈霉菌屬，Iβ1菌株發(fā)酵濾液在溫度為-20～55℃，紫外線照射10～30 min，pH為1.0～9.0條件下均較穩(wěn)定，聚酮合酶基因在其系統(tǒng)分類上與StreptomycesnourseiATCC 11455制霉菌素生物合成基因簇的聚酮合酶基因分枝較近.

鏈霉菌；抗真菌活性；發(fā)酵液；聚酮合酶基因

AbstractA bacterial strain (named as Iβ1) resistant to crop pathogenic fungi was screened from field soil. The strain was identified according to physiological and biochemical characteristics and its sequence homology with 16S rRNA gene. The antifungal stability of the fermentation broth and ketoacyl synthase gene of strain Iβ1 were also analyzed. The results showed that strain Iβ1 was classified asStrepomyces. It was stable in the temperature range from -20 to 55℃, under UV light for 10-30 min and pH 1.0-9.0. The ketoacyl synthase gene of Iβ1 strain was close to the ketoacyl synthase gene of S. noursei ATCC 11455 Nystatin biosynthesis gene cluster in phylogenetic classification.

KeywordsStreptomyces；antifungal activity；fermentation broth；ketoacyl synthase gene

放線菌是自然界中廣泛存在的一種微生物[1,2].以放線菌代謝產(chǎn)物開發(fā)研究的抗生素，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，如醫(yī)療領(lǐng)域的紅霉素、氯霉素、四環(huán)素和克拉維酸等[3,4]，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的井岡霉素、阿福菌素、農(nóng)用鏈霉素和多效霉素等[5,6]，解決了因病原真菌引起農(nóng)作物減產(chǎn)的部分問題.

非核糖體多肽合成酶(NRPS)和多聚酮合酶(PKS)基因是產(chǎn)生活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的功能基因[7]，I型PKS由幾個(gè)攜帶有活性結(jié)構(gòu)域的多肽組成，其中酮基合成酶(KS)結(jié)構(gòu)域基因高度保守. KS基因分析研究不僅可預(yù)知代謝產(chǎn)物類型，還是一種發(fā)現(xiàn)新藥的便捷、低成本手段，對(duì)其進(jìn)行基因工程改造可產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物.本研究從神農(nóng)架地區(qū)土壤中篩選出了1株具有抗農(nóng)作物病原真菌活性的鏈霉菌，研究了菌株發(fā)酵濾液穩(wěn)定性，并對(duì)其KS基因克隆和分析，擬為生物防治和基因簇的異源表達(dá)奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1材料和儀器

從湖北省神農(nóng)架地區(qū)取土壤樣品，裝入無菌袋中，分類標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室，對(duì)微生物進(jìn)行分離. 棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliaekleb)、禾谷鐮刀病菌(Fusariumaminearum) 、腐霉病菌(Botrytiscinerea)、稻瘟病菌168菌株(Magnaporthegrisea168 strain)和立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani) 5株農(nóng)作物病原真菌指示菌，均由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物實(shí)驗(yàn)室保存.

實(shí)驗(yàn)采用PDA 培養(yǎng)基、高氏 I 號(hào)培養(yǎng)基和菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基[8]. 16S rRNA基因 和KS基因引物(北京三博遠(yuǎn)志)，PCR反應(yīng)試劑、克隆載體pMD19-Tvector(大連 TaKaRa)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?凝膠成像儀(TFL-40，Synoptics公司)，PCR儀(PTC-200，Bio-Rad公司).

1.2抗農(nóng)作物病原真菌放線菌的篩選

稱取10 g土樣置于含90 mL無菌水的三角瓶中，于30℃，180 r/min下振蕩2 h，混勻后制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5的土壤懸浮液，分別涂布在含有不同濃度重鉻酸鉀的高氏I號(hào)培養(yǎng)基上，在30℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 d，經(jīng)過多次挑單菌純化后，收集孢子至20%甘油中，-20℃保存.

采用杯碟法[8,9]，以棉花黃萎病菌、禾谷鐮刀病菌、腐霉病菌、稻瘟病菌168菌株和立枯絲核病菌等5株農(nóng)作物病原真菌為指示菌，對(duì)分離到的放線菌進(jìn)行抗菌活性篩選，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑.

1.3菌種鑒定

對(duì)篩選到的菌種進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和生理生化鑒定[10,11]，提取菌株總DNA[12]，采用通用引物F1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和F2(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，dNTP 1.0 μL，一對(duì)引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，用超純水定容至15.0 μL.擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min.測(cè)序結(jié)果通過Blast在GenBank基因庫(kù)中與相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析.利用MEGA 6.0對(duì)Iβ1菌株的16S rRNA基因序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(采取N-J法，bootstrap value為1000).

1.4 Iβ1菌株發(fā)酵濾液穩(wěn)定性檢測(cè)

[8]制備鏈霉菌Iβ1菌株發(fā)酵液，0.22 μm濾膜過濾備用.以稻瘟病菌168菌株為指示菌，取100 μL發(fā)酵濾液，采用杯碟法[8]測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性.

將Iβ1菌株發(fā)酵濾液分別在-20, 4, 37, 55℃的溫度下處理2 h，測(cè)其抑菌活性.將Iβ1菌株發(fā)酵濾液在紫外線下分別處理10,20,30 min，測(cè)其抑菌活性.用酸度計(jì)將Iβ1菌株發(fā)酵濾液的起始pH值分別調(diào)至1.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,13.0，室溫放置12 h后，調(diào)至原始pH值，測(cè)其抑菌活性.

1.5 Iβ1菌株KS基因擴(kuò)增和序列分析

以總DNA為模版，采用引物KSF/KSR[15]，對(duì)KS基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸7 min.測(cè)序結(jié)果通過Blast在GenBank基因庫(kù)中比對(duì)分析.利用MEGA 6.0對(duì)KS基因序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(采取N-J法，bootstrap value為1000).

2 結(jié)果和分析

2.1抗農(nóng)作物病原真菌Iβ1菌株的篩選

以禾谷鐮刀病菌、腐霉病菌、稻瘟病菌168菌株、立枯絲核病菌和棉花黃萎病菌5株農(nóng)作物病原真菌為指示菌，篩選出一株具有抗農(nóng)作物病原真菌活性的Iβ1菌株.菌株對(duì)5種農(nóng)作物病原真菌有不同程度的抑菌活性(見表1)，其中對(duì)禾谷鐮刀病菌、腐霉病菌、稻瘟病菌168菌株、立枯絲核病菌的抑菌圈直徑大于14 mm，表明Iβ1菌株對(duì)禾谷鐮刀病菌、腐霉病菌、稻瘟病菌168菌株、立枯絲核病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性.

表 1 Iβ1菌株對(duì)5株農(nóng)作物病原真菌的抑菌效果

Tab.1 Inhibition effect of Iβ1 strain against five plant pathogenic fungal strains

農(nóng)作物病原真菌抑菌直徑d/mm稻瘟病菌168菌株40.0立枯絲核病菌32.0棉花黃萎病菌12.0腐霉病菌14.0禾谷鐮刀病菌14.0

2.2抗農(nóng)作物病原真菌Iβ1菌株鑒定

在高氏I號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)Iβ1菌株，觀察其菌落形態(tài)特征，光鏡顯示氣生菌絲發(fā)達(dá)，豐富的孢子鏈呈圓球形，基內(nèi)菌絲粗壯、多分枝.如表2所示，在供試的7種培養(yǎng)基上，Iβ1菌株的氣生菌絲均較淺，除在甘油天門冬素培養(yǎng)基上是淺灰色，其他都是白色；而基內(nèi)菌絲和產(chǎn)生的可溶性色素顏色較深.

表2 Iβ1菌株的培養(yǎng)特征Tab.2 Cultural characteristics of Iβ1 strain

Iβ1菌株的生理生化特性如表3所示，Iβ1菌株產(chǎn)生H2S，伏-普實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)和吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性，不能使纖維素分解，可使明膠液化，產(chǎn)生淀粉酶，可利用葡萄糖、乳糖和甘露醇.

表3 Iβ1菌株的生理生化特性

將菌株Iβ1的16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，長(zhǎng)度為1066 bp，通過Blast與GenBank 中相關(guān)菌株的基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株Iβ1與鏈霉菌屬(Streptomyces)的同源性達(dá)到99%.進(jìn)一步采用MEGA6.0 中的 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1000，如圖1所示，Iβ1菌株的16S rRNA基因序列與S.noboritoensisCSSP695的16S rRNA基因序列相似性較高.結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，初步鑒定Iβ1菌株屬于鏈霉菌屬.

圖1 Iβ1菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Iβ1 strain 16S rRNA gene

2.3 Iβ1菌株發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性

Iβ1菌株發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度處理2 h后，抑菌活性無顯著變化(見圖2)，對(duì)稻瘟病菌168菌株的抑菌直徑均大于36 mm，說明Iβ1菌株發(fā)酵濾液在-20,4,37,55℃溫度下有良好的穩(wěn)定性，仍能保持較高的抑菌活性，可在此溫度下短暫保存.

圖2 溫度對(duì)Iβ1菌株發(fā)酵濾液抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the antifungal stability of fermentation broth in Iβ1strain

Iβ1菌株發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線照射10, 20 min后，抑菌活性無顯著變化；照射30 min后，抑菌活性較對(duì)照組降低了12.3%，但發(fā)酵濾液對(duì)稻瘟病菌168菌株的抑菌直徑仍在36 mm以上(見圖3)，說明Iβ1菌株發(fā)酵濾液在紫外線下能保持較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)紫外線不敏感，穩(wěn)定性好.

1) 對(duì)照組CK; 2～4) 紫外線照射10, 20, 30 min圖3 紫外線照射對(duì)Iβ1菌株發(fā)酵濾液抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of UV irradiation on the antifungal stability of fermentation broth in Iβ1strain

Iβ1菌株發(fā)酵濾液經(jīng)不同pH處理后，抑菌活性有變化(見圖4)，pH為1～7時(shí)，抑菌圈直徑隨pH值增加而增加；pH為7時(shí)，抑菌圈直徑最大，穩(wěn)定性最好；pH為7～11時(shí)，抑菌圈直徑隨pH值增加而減?。籶H為11或13時(shí)，Iβ1菌株發(fā)酵濾液無抑菌活性.說明發(fā)酵濾液在酸性和中性條件下有一定穩(wěn)定性，在強(qiáng)堿下會(huì)失去抑菌活性.

圖4 pH對(duì)Iβ1菌株發(fā)酵濾液抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on the antifungal stability of fermentation broth in Iβ1strain

2.4 Iβ1菌株中KS基因的擴(kuò)增與分析

聚酮類化合物是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是抗生素的重要來源.合成聚酮類化合物的基因成簇排列，其中PKS基因簇中KS基因編碼區(qū)的同源性很高.擴(kuò)增得到的Iβ1菌株的KS基因序列長(zhǎng)度為727 bp，通過Blast對(duì)KS基因與NCBI 上的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA6.0 中的 Neighbor-Joining 法對(duì)序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap值為1000).如圖5所示，Iβ1菌株的KS基因與S.nourseiATCC 11455制霉菌素生物合成基因簇(AF263912.1)的聚酮合酶基因nysA分枝較近，相似性為77%.

圖5 Iβ1菌株KS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Iβ1 strain KS gene

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年植物因病害造成的減產(chǎn)量為總產(chǎn)量的10%～15%，病原真菌是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因.近年來，以放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物開發(fā)的農(nóng)用抗生素來防治農(nóng)作物病害已較為普遍，目前國(guó)際上的生物農(nóng)藥已超過100多種，多數(shù)來自鏈霉菌.

本研究從土壤中篩選得到1株具有抗農(nóng)作物病原真菌活性Iβ1菌株.通過形態(tài)、生理生化特征以及16S rRNA基因序列同源性比對(duì)分析，初步鑒定該菌株為鏈霉菌屬.發(fā)酵濾液穩(wěn)定性測(cè)定發(fā)現(xiàn)Iβ1菌株有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和紫外線穩(wěn)定性，在酸性和中性條件下穩(wěn)定，強(qiáng)堿條件下易失活.PCR擴(kuò)增獲得727 bp 的KS基因與StreptomycesnourseiATCC 11455制霉菌素生物合成基因簇的聚酮合酶基因nysA同源性最高，可為農(nóng)作物的生物防治和遺傳工程操作奠定基礎(chǔ).

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ScreeningandIdentificationofStreptomycessp.Iβ1StrainResistanttoCropPathogenicFungiandAnalysisofPolyketoneSynthaseGene

LiXiaohua,MaTingting,GuoJia,HuangYue,MeiFeng,PiTing

(Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission, College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

Q939

A

1672-4321(2017)03-0022-05

2016-12-12

李曉華(1968-)，男，教授，博士，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：lixiaohua@mail.scuec.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31070087，30570046)；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2011CDA079，2008CDB076)；中央高?？蒲谢緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(CZW16005，YCZW15104)