馬鈴薯內(nèi)生真菌E02發(fā)酵液的化學(xué)成分研究

艾洪蓮，楊會(huì)祥，王文祥，楊曼思，何 雋，郭華春,*

(1中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

馬鈴薯內(nèi)生真菌E02發(fā)酵液的化學(xué)成分研究

艾洪蓮1,2，楊會(huì)祥1，王文祥2，楊曼思2，何 雋1，郭華春2,*

(1中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、(半)制備型HPLC等方法從馬鈴薯內(nèi)生真菌E02發(fā)酵液中分離純化得到了13個(gè)化合物，其結(jié)構(gòu)通過波譜學(xué)數(shù)據(jù)分析分別鑒定為：大黃素-8-單甲醚 (1)、6-羥基蘆薈大黃素-8-單甲醚 (2)、1,6-二羥基-3-甲基氧雜蒽酮-8-羧酸酯 (3)、硫赭曲菌素(4)、neuchromenin(5)、檸檬霉素(6)、8-去甲基杜鵑素 (7)、5-羥甲基-2-呋喃甲酸(8)、原兒茶酸(9)、尿嘧啶 (10)、麥角固醇(11)、 (2S,3S,4R,2′R)-2-(2′-羥基二十四碳酰胺)十八烷-1,3,4-三醇(12)和甘露醇(13). 以上化合物均首次從該菌中分離得到.

內(nèi)生真菌；發(fā)酵液；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定

AbstractUsing gel column chromatography, Sephadex LH-20 and (semi-)preparative HPLC，13 compounds were isolated from the fermentation broth of endophytic fungi E02.Their structures were determined to be questin(1), Questinol (2), 1,6-didroxy-3-methylxanthone-8-carboxylate(3), Sulochrin (4), neuchromenin (5), Citromycin (6), 8-demethylfarrerol(7), 5-hydroxymethyl-2-furoic acid(8), protocatechuic acid (9), uracil (10), ergosterol (11), (2S,3S,4R,2′R)-2-(2′-hydroxytetracosanoylamino)octadecane-1,3,4-triol(12), Mannitol (13) on the basis of spectroscopic analysis and comparison with literatures, respectively. All the compounds were isolated from this fungi for the first time.

Keywordsendophytic fungi；fermentation broth；chemical constituents；structural identification

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬多年生草本塊莖植物，是繼水稻、小麥、玉米之后的第四大主糧作物，但在馬鈴薯栽培過程中各種真菌性病害嚴(yán)重影響了馬鈴薯產(chǎn)量. 本文選取健康馬鈴薯植株為材料，分離內(nèi)生真菌，并采用平板對峙拮抗實(shí)驗(yàn)法篩選到一株具有抑制馬鈴薯枯萎病病原真菌(Fusariumoxysporum)、馬鈴薯黑痣病病原真菌(Rhizoctoniasolani)和馬鈴薯早疫病病原真菌(Alternariasolani)的內(nèi)生真菌E02，通過測序獲得的18S rDNA ITS序列進(jìn)行BLAST(http:// blast. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性序列比對分析，將其鑒定為莖點(diǎn)霉屬真菌(Phomasp.). 利用反復(fù)柱層析及高效液相分析制備后，從該菌的次生代謝產(chǎn)物中分離13個(gè)單體化合物，經(jīng)波譜學(xué)(EI-MS，ESI-MS，1D-NMR，2D-NMR等)分析鑒定為大黃素-8-單甲醚 (1)、6-羥基蘆薈大黃素-8-單甲醚 (2)、1,6-二羥基-3-甲基氧雜蒽酮-8-羧酸酯 (3)、硫赭曲菌素(4)、neuchromenin(5)、檸檬霉素(6)、8-去甲基杜鵑素 (7)、5-羥甲基-2-呋喃甲酸(8)、原兒茶酸(9)、尿嘧啶 (10)、麥角固醇(11)、 (2S,3S,4R,2′R)-2-(2′-羥基二十四碳酰胺)十八烷-1,3,4-三醇(12)和甘露醇(13)(圖1). 所有化合物均為首次從該真菌中分離得到. 本文為研究莖點(diǎn)霉屬真菌次生代謝產(chǎn)物抑制馬鈴薯真菌性病害的作用機(jī)制奠定了化學(xué)基礎(chǔ).

圖1 化合物1～13的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of compounds 1-13

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與材料

核磁共振波譜儀(Bruker公司，AM 600型), 其中，1HNMR在500 MHz，400 MHz下測定，13CNMR在125 MHz，100 MHz下測定；Waters Autospec Premier P776質(zhì)譜儀；API QSTAR Pulsar；Jasco-P-1020旋光儀； Bruker Tensor 27 FT-IR型紅外光譜儀；Shimadzu UV-2401PC型分光光度計(jì).

柱色譜材料：柱色譜用硅膠(80～100目和200～300目)與GF254 TLC板(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；反相材料Chromatorex (40～75 μm)(日本Fuji Silysia公司)；分析型HPLC為Agilent 1260，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm)，粒徑5 μm；制備型HPLC為Agilent 1260，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(9.4 mm×150 mm)，粒徑5 μm. 顯色方法為紫外燈下波長254 nm和365 nm處觀察熒光，碘蒸氣顯色及10%硫酸乙醇溶液顯色劑加熱顯色.

1.2真菌發(fā)酵培養(yǎng)

采用平皿轉(zhuǎn)搖瓶液體培養(yǎng)的方法. 培養(yǎng)基：葡萄糖5%、豬肉蛋白胨0.15%、KH2PO4和MgSO4各0.05%；培養(yǎng)條件：溫度24 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，暗培養(yǎng)21 d. 過濾后得發(fā)酵液21 L.

1.3提取和分離

發(fā)酵液濃縮至2 L后，經(jīng)乙酸乙酯萃取6次，將萃取層合并濃縮；菌絲體經(jīng)丙酮浸泡3次，過濾合并后濃縮；共得浸膏100 g. 浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析(石油醚→石油醚-乙酸乙酯→氯仿→氯仿-甲醇→甲醇)和Sephadex LH-20凝膠柱層析(氯仿-甲醇1：1和甲醇)分離得化合物(1)～(13).

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1分子式C16H12O5，棕褐色針狀結(jié)晶.1HNMR(DMSO-d6, 500 MHz)δH7.74(1H，d，J=2 Hz)，7.20(1H，d，J=3 Hz)，7.13(1H，d，J=2 Hz)，6.84(1H，d，J=3 Hz)，3.89(3H，s)，2.49(3H，s). 化合物被確證為大黃素-8-單甲醚.

化合物2分子式C16H12O6，黃色針狀結(jié)晶.1HNMR(Pyr-d5，500 MHz)δH3.87(3H,s, OCH3)，4.56(2H,d,J=5.7 Hz，CH2-OH)，6.83(1H,d,J=2.1 Hz，H-7)，7.20(2H,d,J=2.1 Hz，H-2和H-5)，7.56(1H,s, H-4)，11.24(1H,s, ω-OH)，13.26(1H,s,α-OH). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[1]. 通過結(jié)合HMBC等其他波譜解析確切結(jié)構(gòu)為6-羥基蘆薈大黃素-8-單甲醚.

化合物3分子式C16H12O6，ESI-MS m/z:323(M+Na)+,淡黃色針狀結(jié)晶.1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δH2.35(3H，s)，3.83(3H，s)，6.60(2H，s)，6.77(1H，d，J=2 Hz)，6.84(1H，d，J=2 Hz). 以上氫信號(hào)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[2].13C和DEPT譜顯示有2個(gè)甲基，其中一個(gè)為典型的甲氧基信號(hào)，4個(gè)苯環(huán)上的次甲基信號(hào)，以及10個(gè)季碳信號(hào)，其中有在低場的兩個(gè)羰基信號(hào). 結(jié)合1H和13C以及HMBC譜可以確定化合物3為1,6-二羥基-3-甲基氧雜蒽酮-8-羧酸酯.

化合物4分子式C17H16O7，成棱形晶體.1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δH11.43(1H, br s, OH)，9.98 (1H, br s, OH), 6.88 (1H, d,J=2.0 Hz,H-5)，6.66(1H, d,J=2.0 Hz, H-3)，6.07 (2H, q,J=0.6 Hz,H-3′, 5′)，3.63和3.62(each 3H, s, H3-7, -8), 2.13 (3H, s, H3-7′). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致[3]. 故化合物4的結(jié)構(gòu)確定為硫赭曲菌素.

化合物5分子式C13H12O5，1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δH6.90(1H，s)，6.31(1H，s)，4.91(2H，d，J=12.0 Hz)，4.67(2H，d，J=12.0 Hz)，4.64(m)，2.55(2H，dd，J=17.0，13.0 Hz)，2.49(2H，dd，J=17.0，4.0 Hz)，1.45(3H，d，J=6.0 Hz). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本相符[4]. 故化合物5被鑒定為neuchromenin.

化合物6分子式C13H10O5，綠色針狀結(jié)晶.1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δH6.98(1H，s，H-13)，6.36(1H，s，H-10)，6.13(1H，s，H-3)，4.94(2H，s，H-63)，2.30(3H，s，H-1).13C和DEPT譜顯示C-1為甲基，C-6為亞甲基，C-3，10，13為次甲基，其余為季碳.13CNMR(125 HMz)δC174.93(C-4)，164.55(C-2)，155.51(C-7)，150.84(C-9)，150.49(C-11)，140.92(C-12)，113.34(C-3)，110.27(C-5)，108.66(C-13)，106.21(C-8)，103.97(C-10)，62.34(C-6)，19.21(C-1). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比基本一致[5]. 故化合物6為檸檬霉素.

化合物7分子式C16H14O5，白色無定形粉末.1HNMR(Acetone-d6，400 MHz)δ H 7.39(2H，d,J=8.4 Hz,H-2′,6′)，6.90(2H，d,J=8.4 Hz,H-3′,5′)，6.02(1H，s,H-8)，5.42(1H，dd,J=12.8,2.8 Hz,H-2′,3′)，3.19(1H，dd,J=17.2,12.8 Hz,H-3a)，2.72(1H，dd,J=17.2,2.8 Hz,H-3b)，2.08(3H，s,6-CH3). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[6]. 故化合物7被確定為8-去甲杜鵑素.

化合物8分子式C6H6O4.1HNMR (Acetone-d6，500 MHz)δH7.15(1H，d，J=3.4 Hz，H-3)，6.46(1H，d，J=3.4 Hz，H-3)，4.58(2H，CH2OH). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[7]. 故化合物8為 5-羥甲基-2-呋喃甲酸.

化合物9分子式C7H6O4，白色粉末.1HNMR (CD3OD，500 MHz)δH7.43(1H，d，J=2 Hz，H-2)，7.40(1H，dd，J=2，8.5 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.5 Hz，H-5). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本相同[8]. 故化合物9為原兒茶酸.

化合物10分子式C4H4N2O2.1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δ H 11.01(1H，s，brs，NH-3)，10.81(1H，s，brs，NH-1)，7.38(1H，d，J=5.9 Hz)，5.43(1H，d,J=5.9 Hz). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致[9]. 故化合物10為尿嘧啶.

化合物11分子式C28H44O，無色針狀結(jié)晶. mp.175 ℃，[α]D20-135°(c=1.2，CDCl3)，13CNMR(CDCl3，125 MHz)δC141.31(C-8)，139.71(C-5)，135.54(C-22)，132.00(C-23)，119.59(C-6)，116.30(C-7)，70.40(C-3)，55.78(C-17)，54.55(C-14)，46.27(C-9)，42.82(C-13和C-24)，40.81(C-4)，40.35(C-20)，39.09(C-12)，38.37(C-1)，37.04(C-10)，33.08(C-25)，32.00(C-2)，28.20(C-16)，22.07(C-15)，21.09(C-11和 C-21)，19.96(C-26和C-27)，17.58(C-28)，16.25(C-19)，12.03(C-18). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的ergosterol相符合[10]. 故化合物11確定為麥角固醇.

化合物12分子式C42H85NO5,白色無定形粉末(丙酮), m.p.139～141 ℃(文獻(xiàn)值 140～142 ℃). 在1HNMR和13CNMR譜中，出現(xiàn)了兩個(gè)末端甲基信號(hào)δH0.87(t,J=6. 7 Hz,6H)和δH1.26～1.31強(qiáng)質(zhì)子信號(hào)推測有兩個(gè)脂肪烴烷基單鏈，出現(xiàn)δH8.59(1H, d，J=8.8 Hz，NH)和δC175.42(C-1′，CONH)，出現(xiàn)δH5.15(1H, m,H-2)和δC53.12 (CHNH，C-2)及連氧碳信號(hào)δC62.12(C-1)，76.92(C-3)，73.12(C-4)，72.62(C-2′)顯示有酰胺鍵和多羥基存在. 通過以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]的數(shù)據(jù)比較，化合物12的結(jié)構(gòu)確定為(2S,3S,4R,2′R)-2-(2′-羥基二十四碳酰氨基)十八碳-1,3,4-三醇.

化合物13分子式C6H16O,白色粉末，m.p.130～132 ℃.1HNMR (DMSO-d6，500 MHz)δH3.59(2H，dd，J=10.8，3.6 Hz)，3.58(2H，d，J=8.0 Hz)，3.54(1H，dd，J=6.0，3.6 Hz)3.52(1H，dd，J=8.0，3.6 Hz)3.50(2H，dd，J=10.8，6.0 Hz).13CNMR(DMSO-d6，125 MHz)δC70.71(C-3，4)，69.15(C-2，5)，63.14(C-1，6)，DEPT譜顯示C-2，3，4，5為CH，C-1，6為CH2. 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本相同[12]. 故化合物13確定為甘露醇.

3 結(jié)語

內(nèi)生真菌(Endophytic Fungi) 普遍存在于植物中，是生活在植物組織內(nèi)的一類微生物，具有分布廣、種類多的特點(diǎn). 內(nèi)生菌在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，與宿主建立了長期和諧的共生關(guān)系. 其次生代謝產(chǎn)物十分豐富(如萜類、生物堿類、酯類、黃酮類、醌類和蒽衍生物、甾體類等)，并且具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲、調(diào)節(jié)免疫及促進(jìn)植物生長等生物活性，是篩選生物活性成分或先導(dǎo)化合物的有效途徑之一. 在醫(yī)藥領(lǐng)域和農(nóng)藥領(lǐng)域植物內(nèi)生菌是目前研究的熱點(diǎn). 本文采用多種柱層析手段對內(nèi)生真菌E02發(fā)酵液的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，并利用多種現(xiàn)代波譜手段確定了13個(gè)化合物，為后續(xù)研究內(nèi)生真菌E02次生代謝產(chǎn)物抑制馬鈴薯枯萎病、馬鈴薯黑痣病和馬鈴薯早疫病的作用機(jī)制奠定了化學(xué)基礎(chǔ).

[1] 劉振麗, 李林福, 巢志茂, 等. 何首烏炮制后化學(xué)成分的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009, 21(2): 239-241, 248.

[2] Hamasaki T, Kimur Y. Isolation and structures of four new metabolites fromAspergilluswentii[J]. Agric Biol Chem, 1983, 47 (1), 163-165.

[3] Hargreaves J, Park J O, Ghisalberti E L, et al. New chlorinated diphenyl ethers from anAspergillusspecies[J]. J Nat Prod, 2002, 65(1):7-10.

[4] Gao J M, Dong Z J, Liu J K. A new ceramide from the basidiomyceteRussulacyanoxanthan[J]. Lipids, 2001, 36(2):175-180.

[5] 元 超, 李 剛, 吳長生, 等. 地衣內(nèi)生菌Myxotrichumsp.的代謝產(chǎn)物的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 26(4):513-516,560.

[6] 李干鵬, 羅 陽, 李尚秀, 等. 小葉杜鵑花的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2014,45(12):1668-1672.

[7] Matsui T, Kudo A, Tokuda S, et al. Identification of a new natural vasorelaxatant compound,(+)-Osbeckic acid, from rutin-free tartary buckwheat extract[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(20):10876-10879.

[8] Miyazawa M, Oshima T, Tokura M, et al. Suppression of chemical mutagens-induced SOS response by phenolic acids from black rice bran usingSalmonellatyphimuriumTA1535/pSK1002 umu test[J]. J Oleo Sci, 2003, 52(9):471-481.

[9] Ding Z G, Zhao J Y, Yang P W, et al.1H and13C NMR assignments of eight nitrogen containing compounds fromNocardiaalbasp. nov (YIM 30243T)[J]. Magn Reson Chem, 2011, 47(4): 366-370.

[10] Smith W B. The carbon-13 spectra of steroids on the way to ecdysone[J]. Organic Magnetic Resonance, 1977, 9(11):644-648.

[11] Hayakawa Y, Yamamoto H, Tsuge N, et al. Structure of a new microbial metabolite, neuchromenin[J]. Tetrahedron Letters, 1996, (37)35:6363-6364.

[12] 湯海峰, 易楊華, 姚新生, 等. 褐藻果葉馬尾藻化學(xué)成分的研究[J]. 中國海洋藥物雜志, 2002, 21(6):11-15.

StudiesontheChemicalConstituentsfromEndophyticFungifromSolanumtuberosum

AiHonglian1,2,YangHuixiang1,WangWenxiang2,YangMansi2,HeJuan1,GuoHuachun2

(1College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

O692.3；Q946.88

A

1672-4321(2017)03-0039-04

2017-05-24 *

陳雪嬌，研究方向：心血管藥物的篩選及其作用機(jī)制，E-mail: chenxuejiao@mail.kib.ac.cn

收稿日期2017-07-18 *通訊作者郭華春，研究方向：馬鈴薯栽培與推廣應(yīng)用，E-mail：ynghc@126.com

艾洪蓮(1981-)，女，講師，博士，研究方向：民族藥用植物學(xué)，E-mail：2015050@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31560010),中南民族大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CZY16010,CZW17094,CSP17067)