大白菜BrTILs基因鑒定及功能分析

楊翠翠，崔冰，張一卉，李景娟，李化銀，劉立鋒，王鳳德，高建偉

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家蔬菜改良中心山東分中心，山東 濟(jì)南 250100；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100； 3.曹縣第一中學(xué)， 山東 菏澤 274200)

大白菜BrTILs基因鑒定及功能分析

楊翠翠1,3，崔冰1,2*，張一卉1，李景娟1，李化銀1，劉立鋒1，王鳳德1，高建偉1

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家蔬菜改良中心山東分中心，山東 濟(jì)南 250100；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100； 3.曹縣第一中學(xué)， 山東 菏澤 274200)

溫度誘導(dǎo)載脂蛋白(temperature induced lipocalin, TIL)在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆境脅迫方面具有重要作用。本研究利用生物信息學(xué)方法，從大白菜基因組中鑒定獲得4個(gè)TILs基因(被命名為BrTILs)，它們不均勻分布在大白菜2、3、10號(hào)染色體上。通過(guò)對(duì)其基因和蛋白特征的分析發(fā)現(xiàn)，BrTILs基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)414～750 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白氨基酸長(zhǎng)度為137～249 aa，分子量15.71～28.41 kD，等電點(diǎn)4.90～9.25。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BrTILs基因不同成員的DNA序列存在高度的相似性，但不同成員的exon/intron結(jié)構(gòu)存在較大差異。利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)BrTILs基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同成員在不同組織中的表達(dá)以及對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)模式方面存在較大差異，這可能與它們的啟動(dòng)子區(qū)具有不同的順式響應(yīng)元件有關(guān)。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因發(fā)現(xiàn)，雖然它們的表達(dá)模式存在較大差異，但是二者在抗溫度和鹽脅迫中的功能相似。過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因都不能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)溫度脅迫的基礎(chǔ)抗性，但二者均可提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的抗性。本研究不僅為我們?nèi)媪私獯蟀撞薚ILs基因功能奠定基礎(chǔ)，也為大白菜抗逆分子育種提供了重要參考。

大白菜；TIL基因；溫度脅迫；鹽脅迫

AbstractThe temperature induced lipocalin (TIL) protein plays an important role in the regulation of plant growth and development as well as the resistance to various stresses. In this study, four TIL genes were identified from the Chinese cabbage genome by bioinformatics method, and they were unevenly distributed on the Chinese cabbage chromosomes of A02, A03 and A10. Through the analysis of their gene and protein characteristics, it was found that the coding region of the four TIL genes were 414～750 bp, the predicted amino acid length were 137～249 aa, the molecular weight were 15.71～28.41 kD, and the pI value were 4.90～9.25. The multiple sequence alignment revealed that the DNA sequences of differentBrTILswere highly similar, while their exon/intron structures were largely different. Furthermore, the expression pattern ofBrTILgenes were analyzed using real-time quantitative PCR method (qRT-PCR). It was shown that differentBrTILshad different expression patterns in different tissues of Chinese cabbage and the response patterns to temperature stress were also different, which might be related to different cis-elements in their promoter regions. The over-expression ofBrTIL2 andBrTIL4 genes inArabidopsisrevealed that they both had similar functions in response to temperature and salt stress although their expression patterns had big differences. For example, over-expression ofBrTIL2 andBrTIL4 genes could not improve the resistance to temperature stress, but could enhance the resistance to salt stress. This study not only provides a basis for the comprehensive understanding of the function ofTILgenes in Chinese cabbage, but also provides important references for their applications in molecular breeding of Chinese cabbage.

KeywordsChinese cabbage;TILgene; Temperature stress; Salt stress

載脂蛋白(lipocalins)是一個(gè)古老的、功能多樣的蛋白家族，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物中[1-5]。2002年，人們從小麥和擬南芥中分離鑒定出第一個(gè)植物載脂蛋白[6]。由于植物載脂蛋白受溫度脅迫誘導(dǎo)而顯著表達(dá)，因此又被命名為溫度誘導(dǎo)載脂蛋白(temperature induced lipocalin, TIL)。近幾年的研究表明，TIL在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗溫度脅迫、鹽脅迫和氧化脅迫等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-11]。

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)起源于中國(guó)，是我國(guó)分布最廣、種植面積最大的蔬菜作物，常年種植面積2×106公頃左右，素有“國(guó)菜”之稱(chēng)。多年的生產(chǎn)實(shí)踐表明，大白菜不耐高溫、冷凍，對(duì)高鹽、干旱等逆境脅迫也非常敏感。因此，挖掘與大白菜抗逆境脅迫相關(guān)的基因并用于大白菜分子設(shè)計(jì)育種將有助于培育具有較強(qiáng)逆境脅迫抗性的大白菜新品種。基于TIL基因已取得的研究進(jìn)展，本研究擬對(duì)大白菜TILs基因的組成、表達(dá)模式以及功能等進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為大白菜抗逆分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1植物材料

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)為山東地方品種福山包頭，擬南芥為哥倫比亞野生型(Col-0)。

1.2BrTILs基因鑒定及分析

以擬南芥AtTIL(AT5G58070)蛋白序列為探針在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Brassicadatabase，http://brassicadb.org/brad/)[12,13]中進(jìn)行BlastP檢索，參數(shù)默認(rèn)。然后利用基因ID號(hào)下載所有BrTILs成員的DNA和蛋白序列用于后期分析。

利用ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析BrTILs蛋白的氨基酸長(zhǎng)度、分子量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；利用Gene Structure Display Server在線分析軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析BrTILs基因的exon/intron組成結(jié)構(gòu)；利用大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的syntenic gene在線分析工具(http://brassicadb.org/brad/searchSyntenytPCK.php)分析擬南芥和大白菜TILs基因之間的共線性關(guān)系；利用DNAMAN 6.0.40軟件對(duì)擬南芥和大白菜TILs基因序列進(jìn)行多重比對(duì)分析；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析軟件對(duì)BrTILs基因起始密碼子上游1.5 kb范圍進(jìn)行順式響應(yīng)元件分析。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別采用Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國(guó))和cDNA第一鏈合成試劑盒(TaKaRa，大連寶生物)，步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4表達(dá)模式分析

BrTILs基因在不同組織器官中的表達(dá)模式分析：分別提取包心初期(23～25葉期)根、莖、蓮座葉、包葉以及開(kāi)花期盛開(kāi)的花、受精后10天的果莢和花蕾的總RNA，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以大白菜Actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法分析其表達(dá)模式，所用引物如表1。

BrTILs基因?qū)Ω邷睾偷蜏孛{迫的響應(yīng)模式分析：將種子表面消毒后播種于裝滿(mǎn)營(yíng)養(yǎng)土(草炭土∶蛭石=1∶3)的小花盆(7 cm×7 cm)內(nèi)，每盆4棵，然后20℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出第三片真葉時(shí)(約兩周)，進(jìn)行高溫(35℃)和低溫(4℃)脅迫處理，并在處理0、1、3、6、9、12 h時(shí)分別取樣。提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以大白菜Actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用RT-qPCR方法分析其表達(dá)模式，所用引物如表1。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.5基因克隆

根據(jù)BrTILs基因序列設(shè)計(jì)克隆引物如下：BrTIL2-F:5′-CGGGATCCGGAAGAAAAGATGACGC-AA-3′, BrTIL2-R:5′-GCTCTAGACTGTAACTATT-TGCCGAACATAGA-3′; BrTIL4-F:5′-CGGGATCC-GAGAAGAAAAGATGACGTCGACGGA-3′, BrTIL4-R:5′-GCTCTAGAGCGTCCATGTGTATCTACTTGCCG-A-3′，帶下劃線堿基分別為BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到克隆載體pMD18-T(TaKaRa，大連寶生物)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序鑒定。

1.6植物表達(dá)載體構(gòu)建

用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XbaⅠ(TaKaRa)分別雙酶切含目的基因的克隆載體和植物表達(dá)載體pCAMBIA-2300，然后電泳、切膠回收目的基因片段和線性pCAMBIA-2300植物表達(dá)載體，最后用T4 DNA連接酶(TaKaRa)連接回收片段。

1.7轉(zhuǎn)基因植株的獲得及表型分析

首先將構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后利用浸滲花蕾法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。通過(guò)卡那霉素抗性篩選、PCR擴(kuò)增的方法，經(jīng)過(guò)至少兩代以上的篩選鑒定獲得分別過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體植株。

低溫脅迫處理：將正常條件下(20℃、16 h光照/8 h黑暗)生長(zhǎng)30 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)入4℃培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)48 h，然后測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

高溫脅迫處理：將正常條件下生長(zhǎng)30 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)入40℃培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)24 h，然后測(cè)定Fv/Fm值。

NaCl脅迫處理：利用200 mmol/L NaCl溶液處理正常條件下生長(zhǎng)30 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥，處理21 d后測(cè)定Fv/Fm值。

Fv/Fm值采用便攜式熒光儀(Handy PEA)測(cè)定，測(cè)定時(shí)將Handy PEA光源強(qiáng)度調(diào)整為 3 000 μmol/(m2·s)(飽和光強(qiáng))，作用光為波峰650 nm的紅光，熒光信號(hào)記錄時(shí)程2 s。另外，測(cè)定前需將植株葉片暗適應(yīng)至少30 min。

上述試驗(yàn)均以轉(zhuǎn)空載體植株(vector)作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1BrTILs基因鑒定及序列分析

以擬南芥TIL(AT5G58070)蛋白的氨基酸序列為探針，利用BlastP技術(shù)對(duì)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/)進(jìn)行搜索，共獲得4個(gè)大白菜TILs基因(基因ID分別為：Bra020391、Bra020393、Bra006784和Bra002674)，根據(jù)它們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置分別命名為BrTIL1、BrTIL2、BrTIL3和BrTIL4(表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)BrTILs基因的編碼序列(CDS)長(zhǎng)度為414～750 bp，預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度為137～249 aa，分子量為15.71～28.41 kD，等電點(diǎn)為4.90～9.25。

表2大白菜BrTILs基因及其編碼蛋白特征分析

基因基因號(hào)染色體正反鏈所在位置編碼序列蛋白長(zhǎng)度(aa)分子量(kD)等電點(diǎn)BrTIL1Bra020391A02+5501909/550386475024928.414.90BrTIL2Bra020393A02+5507094/550774056418721.566.10BrTIL3Bra006784A03+5039845/504049556418721.435.97BrTIL4Bra002674A10_8365381/836579441413715.719.25

利用DNAMAN軟件對(duì)大白菜和擬南芥TILs基因的核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BrTILs與AtTIL基因之間具有較高的序列一致性和保守性，其中BrTIL2與AtTIL基因之間的序列相似性高達(dá)85.64%(圖 1)。這種序列上的高度一致性說(shuō)明它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖1大白菜與擬南芥TILs基因序列多重比對(duì)分析

大白菜和擬南芥都屬于十字花科植物，二者具有較近的親源關(guān)系和良好的基因組共線性關(guān)系[14]。根據(jù)Brassicadatabase中共線性數(shù)據(jù)(http://brassicadb.org/brad/searchSynteny.php)可知，BrTIL1、BrTIL3和BrTIL4與AtTIL屬于共線性基因，而B(niǎo)rTIL1和BrTIL2則屬于串聯(lián)重復(fù)基因。

另外，通過(guò)對(duì)擬南芥和大白菜TILs基因的exon/intron結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，AtTIL、BrTIL2和BrTIL3基因含有1個(gè)內(nèi)含子，BrTIL1基因含有2個(gè)內(nèi)含子，而B(niǎo)rTIL4基因則不含有內(nèi)含子(圖 2)。

圖2擬南芥和大白菜TILs基因的exon/intron結(jié)構(gòu)分析

2.2BrTILs基因啟動(dòng)子區(qū)順式響應(yīng)元件分析

為了研究BrTILs基因的生物學(xué)功能，我們利用PlantCARE在線分析軟件對(duì)其起始密碼子(ATG)上游1.5 kb序列進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)BrTILs基因啟動(dòng)子區(qū)除了都含有TATA-box和CAAT-box外，還有多個(gè)其它順式響應(yīng)元件。但不同BrTILs基因啟動(dòng)子區(qū)所含有的順式響應(yīng)元件的種類(lèi)和數(shù)量存在較大差別。例如，BrTIL1基因啟動(dòng)子區(qū)不存在HSE順式響應(yīng)元件，而B(niǎo)rTIL2、BrTIL3和BrTIL4則分別存在4、1、2個(gè)HSE順式響應(yīng)元件。這種順式響應(yīng)元件種類(lèi)和數(shù)量的不同暗示不同基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)外界脅迫的過(guò)程中可能發(fā)揮不同的作用。

表3大白菜和擬南芥TILs基因啟動(dòng)子區(qū)順式響應(yīng)元件分析

注：ABRE (cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness)、ARE (cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction)、ERE (ethylene-responsive element)、CAT-box (cis-acting regulatory element related to meristem expression)、G-box (cis-acting regulatory element involved in light responsiveness)、GARE-box (gibberellin-responsive element)、GT1-motif (light responsive element)、HSE (cis-acting element involved in heat stress responsiveness)、MBS (MYB binding site involved in drought-inducibility)、TCA-element (cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness)、TGA-element (auxin-responsive element)、circadian (cis-acting regulatory element involved in circadian control)。

2.3BrTILs基因表達(dá)模式分析

2.3.1BrTILs在不同組織器官中的表達(dá)模式 利用RT-qPCR方法對(duì)BrTILs基因在不同組織器官中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同BrTILs基因的表達(dá)模式存在顯著差異。其中，BrTIL1基因在所有被檢測(cè)組織中均未見(jiàn)表達(dá)；BrTIL2和BrTIL3基因均在結(jié)球初期的成熟葉中表達(dá)量最高，但分別在根和花蕾中表達(dá)量最低；BrTIL4基因則在盛開(kāi)的花中表達(dá)量最高，在短縮莖中表達(dá)量最低。這種組織表達(dá)的特異性可能暗示不同成員在調(diào)控大白菜器官發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。

圖3 大白菜TILs基因在不同組織中的表達(dá)模式

2.3.2BrTILs基因?qū)Ω邷睾偷蜏靥幚淼捻憫?yīng)模式 如圖4所示，在高溫和低溫處理后均檢測(cè)不到BrTIL1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(未作圖)；高溫處理誘導(dǎo)BrTIL2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而抑制BrTIL4基因的表達(dá)；低溫處理誘導(dǎo)BrTIL4基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而抑制BrTIL2基因的表達(dá)；高溫和低溫處理都抑制BrTIL3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明不同BrTILs基因在響應(yīng)大白菜溫度脅迫中可能發(fā)揮不同的作用。

圖4 大白菜TILs基因?qū)Ω邷睾偷蜏靥幚淼捻憫?yīng)模式

2.4過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥耐溫度脅迫的影響

待植株長(zhǎng)到7～8片葉時(shí)，分別對(duì)轉(zhuǎn)空載體(vector)、過(guò)量表達(dá)BrTIL2和過(guò)量表達(dá)BrTIL4基因的擬南芥進(jìn)行40℃高溫和4℃低溫處理。然后在高溫處理24 h和低溫處理48 h時(shí)測(cè)定過(guò)量表達(dá)和對(duì)照植株的Fv/Fm值。結(jié)果表明，在高溫和低溫處理后，對(duì)照和BrTIL2和BrTIL4轉(zhuǎn)基因植株的Fv/Fm值都有不同程度的降低。但比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照與過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4植株之間的Fv/Fm值并不存在顯著差異(表4和表5)。說(shuō)明過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因并沒(méi)有顯著改變擬南芥的基礎(chǔ)耐熱性和耐冷性。

2.5過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥耐NaCl脅迫的影響

待植株長(zhǎng)到7～8片葉時(shí)，用200 mmol/L NaCl溶液處理對(duì)照、過(guò)量表達(dá)BrTIL2和過(guò)量表達(dá)BrTIL4基因的擬南芥植株，處理21 d時(shí)測(cè)定Fv/Fm值。結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl處理21 d時(shí)，對(duì)照、BrTIL2和BrTIL4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的Fv/Fm值都明顯降低，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株都造成了傷害。但比較發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因植株的Fv/Fm值顯著高于對(duì)照，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)NaCl脅迫的抗性。

表4 過(guò)量表達(dá)BrTIL2基因?qū)囟让{迫下擬南芥Fv/Fm值的影響

注：試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，轉(zhuǎn)基因株系與野生型之間的差異顯著性用兩組數(shù)據(jù)的成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，標(biāo)記“ns”表示差異不顯著，標(biāo)記“*”表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記“**”表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

表5 過(guò)量表達(dá)BrTIL4基因?qū)囟让{迫下擬南芥Fv/Fm值的影響

表6過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因?qū)aCl脅迫下擬南芥Fv/Fm值的影響

3 討論與結(jié)論

大白菜與擬南芥同屬于十字花科植物，在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。但是擬南芥基因組中僅有一個(gè)TIL成員[15]，而我們從大白菜基因組中鑒定得到4個(gè)TILs成員。Wang等[12]的研究認(rèn)為，大白菜和擬南芥起源于共同的祖先，然而在進(jìn)化過(guò)程中大白菜基因組發(fā)生了3倍化復(fù)制。此外，在進(jìn)化過(guò)程中BrTIL1基因自身也發(fā)生了一次復(fù)制并形成BrTIL2基因，從而最終導(dǎo)致大白菜基因組中存在4個(gè)TILs基因。

通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BrTILs基因之間存在高度的序列保守性。但通過(guò)表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)BrTILs基因之間的表達(dá)模式存在較大的差異，說(shuō)明不同的大白菜TIL成員在調(diào)控大白菜生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中可能是通過(guò)不同的方式實(shí)現(xiàn)的。另外，通過(guò)對(duì)不同成員啟動(dòng)子區(qū)順式響應(yīng)元件的分析也部分證明了上述推測(cè)，因?yàn)椴煌珺rTILs基因啟動(dòng)子區(qū)的順式響應(yīng)元件的數(shù)量和種類(lèi)存在顯著差異。

光合作用對(duì)脅迫傷害最為敏感，因此逆境環(huán)境中光合作用的提高是植物抗逆性增強(qiáng)的重要表現(xiàn)[16-18]，而光系統(tǒng)Ⅱ的Fv/Fm值則可以作為探測(cè)光合作用強(qiáng)弱的探針[19]。在本研究中，高溫和低溫處理后不同基因型擬南芥的Fv/Fm值都不同程度降低，但它們之間并未表現(xiàn)出顯著差異，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因并沒(méi)有顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)溫度脅迫的抗性，這與Chi等[7]的研究結(jié)果一致。Chi等研究發(fā)現(xiàn)，AtTIL1基因功能缺失會(huì)導(dǎo)致植株耐熱性缺陷，但過(guò)量表達(dá)AtTIL1基因并不能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性。也就是說(shuō)，AtTIL1對(duì)于高溫下植物的耐受性是必需的，但其本身又不足以抵抗熱脅迫。

Abo-Ogiala等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AtTIL可以在鹽脅迫條件下保護(hù)葉綠體免受鹽離子的毒害。在本研究中，我們也得到了類(lèi)似的結(jié)果，鹽脅迫條件下，過(guò)量表達(dá)BrTIL2和BrTIL4基因的擬南芥植株的Fv/Fm值顯著高于野生型，說(shuō)明過(guò)量表達(dá)BrTILs基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

總之，本研究不僅為我們?nèi)媪私獯蟀撞薚ILs基因功能奠定了基礎(chǔ)，也為大白菜抗逆分子育種提供了重要參考。

[1] Akerstrom B, Flower D R, Salier J P. Lipocalins: unity in diversity[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2000, 1482 (1/2): 1-8.

[2] Bishop R E. The bacterial lipocalins[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2000,1482 (1/2): 73-83.

[3] Rassart E, Bedirian A, Do Carmo S, et al. Apolipoprotein D[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2000, 1482 (1/2):185-198.

[4] Sánchez D, Ganfornina M D, Bastiani M J. Lazarillo, a neuronal lipocalin in grasshoppers with a role in axon guidance[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2000, 1482 (1/2): 102-109.

[5] Sánchez D, Ganfornina M D, Gutiérrez G, et al. Exonintron structure and evolution of the lipocalin gene family[J]. Molecular Biology & Evolution, 2003, 20 (5): 775-783.

[6] Charron J B F, Breton G, Badawi M, et al. Molecular and structural analyses of a novel temperature stress-induced lipocalin from wheat andArabidopsis[J]. FEBS Lett., 2002, 517 (1/3):129-132.

[7] Chi W, Fung R M, Liu H, et al. Temperature induced lipocalin is required for basal and acquired thermotolerance inArabidopsis[J]. Plant Cell & Environment, 2009, 32(7): 917-927.

[8] Uemura M, Tominaga Y, Nakagawara C, et al. Responses of the plasma membrane to low temperatures[J]. Physiologia Plantarum, 2006, 126: 81-89.

[9] Charron J B F, Ouellet F, Houde M, et al. The plant Apolipoprotein D ortholog protectsArabidopsisagainst oxidative stress[J]. BMC Plant Biology, 2008, 8(1): 1-12.

[10] Boca S,Koestler F,Ksas B,et al.Arabidopsislipocalins AtCHL and AtTIL have distinct but overlapping functions essential for lipid protection and seed longevity[J]. Plant Cell & Environment,2013,37(2):368-381.

[11] Abo-Ogiala A,Carsjens C,Diekmann H,et al. Temperature-induced lipocalin (TIL) is translocated under salt stress and protects chloroplasts from ion toxicity[J]. Journal of Plant Physiology,2014,171(3/4):250-259.

[12] Wang X, Wang H, Wang J, et al. The genome of the mesopolyploid crop speciesBrassicarapa[J]. Nature Genetics,2011,43:1035-1039.

[13] Cheng F, Mandáková T, Wu J, et al. Deciphering the diploid ancestral genome of the mesohexaploidBrassicarapa[J]. Plant Cell,2013,25:1541-1554.

[14] 方璐, 程鋒, 武劍, 等. 全基因組與串聯(lián)復(fù)制后白菜基因的保留[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2012(11): 9-14.

[15] Charron J B F, Ouellet F, Pelletier M, et al. Identification, expression, and evolutionary analyses of plant lipocalins[J]. Plant Physiology, 2005, 139:2017-2028.

[16] Baker N R. A possible role for photosystem Ⅱ in environmental perturbation of photosynthesis[J]. Physiologia Plantarum, 1991, 81:563-570.

[17] 王玉麗, 孫居文, 荀守華, 等. 干旱脅迫對(duì)東岳紅光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉片相對(duì)含水量的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017，49(4): 46-50.

[18] 陳露露, 王秀峰, 劉美, 等. 外源鈣對(duì)干旱脅迫下黃瓜幼苗葉片膜脂過(guò)氧化和光合特性的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48(4):28-33.

[19] Baker N R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesisinvivo[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2008, 59: 89-113.

IdentificationandFunctionalAnalysisofBrTILGenesinChineseCabbage(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)

Yang Cuicui1,3, Cui Bing1,2*, Zhang Yihui1, Li Jingjuan1, Li Huayin1, Liu Lifeng1, Wang Fengde1, Gao Jianwei1

(1.InstituteofVegetablesandFlowers,ShandongAcademyofAgriculturalSciences/ShandongProvincialKeyLaboratoryofGreenhouseVegetableBiology/ShandongBranchofNationalVegetableImprovementCenter,Jinan250100,China; 2.CollegeofLifeSciences,ShandongNormalUniversity,Jinan250100,China; 3.CaoxianNo.1SeniorHighSchool,Heze274200,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.003

2017-05-12

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2015YL071)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471884)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃項(xiàng)目(NKYSCS-01)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)遺傳育種崗位(SDAIT-05-04)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CXGC2016A02)

楊翠翠(1988—)，女，碩士研究生，主要從事蔬菜分子生物學(xué)研究。E-mail: cuixuncui@126.com 崔冰(1990—)，男，碩士研究生，主要從事蔬菜分子生物學(xué)研究。E-mail: bice1981@sina.com *同等第一作者。

王鳳德(1979—)，男，副研究員，主要從事蔬菜分子生物學(xué)研究。E-mail: wfengde@163.com 高建偉(1967—)，男，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail: jianweigao3@qq.com

S643.1：Q78

A

1001-4942(2017)09-0012-07