電洗脫法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因組測(cè)序DNA樣品純化中的應(yīng)用*

鄒丹丹, 唐祥海， 莫照蘭, 茅云翔**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3. 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

電洗脫法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因組測(cè)序DNA樣品純化中的應(yīng)用*

鄒丹丹1,2, 唐祥海1,2， 莫照蘭3, 茅云翔1,2**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3. 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

紫菜腐霉(Pythiumporphyrae)是一種專性侵染紫菜并引起紫菜赤腐病的病原菌。為了深入了解紫菜腐霉的遺傳信息，本文計(jì)劃對(duì)其開展全基因組測(cè)序，而制備高質(zhì)量的DNA樣品是關(guān)鍵性工作。海洋生物生境和代謝的特殊性，細(xì)胞中富含的一些次級(jí)代謝物質(zhì)往往影響著DNA樣品的質(zhì)量。紫菜腐霉的基因組DNA樣品中具有嚴(yán)重的RNA污染，即使通過延長(zhǎng)RNase A降解時(shí)間和增加降解次數(shù)也不能完全消除其中的RNA，無法獲得滿足于PacBio文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序的DNA樣品。本研究首先通過瓊脂糖凝膠電泳 (Agarosegel electrophoresis, AGE)來區(qū)分DNA和RNA, 然后將DNA條帶所在的膠塊切下并放入透析袋中繼續(xù)電泳，使DNA從膠條中遷移到透析袋內(nèi)的緩沖液中，從而獲得DNA的TAE溶液。然后通過透析的方法去除DNA的TAE溶液中的乙酸鈉，最終獲得DNA的TE溶液。經(jīng)AGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA條帶清晰、無RNA污染；經(jīng)脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA完整性較好，可用于PacBio文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序。

紫菜腐霉；基因組DNA；RNA污染；透析

紫菜是一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻。隨著紫菜栽培技術(shù)的發(fā)展，栽培面積的不斷擴(kuò)大，紫菜病害頻發(fā)，其中紫菜赤腐病(the red rot disease)是最嚴(yán)重影響紫菜產(chǎn)量和品質(zhì)的病害之一[1]。而且是目前紫菜病害中唯一的一個(gè)病原明確且由單一物種引起的病害[2]，引起紫菜赤腐病的病原菌是紫菜腐霉(P.porphyrae)，它隸屬于卵菌綱 (Oomycota)、霜霉目(Peronosporates)、腐霉科(Pythiaeeae)、腐霉屬(Pythium)[3]。由于人們對(duì)紫菜腐霉遺傳背景了解較少，赤腐病發(fā)病誘因不明，缺乏快速檢測(cè)病情的手段，也沒有高效的抑病、治病手段和方法。傳統(tǒng)的紫菜病害控制方法僅在感病初期具有一定的控制效果[4]，因此通過全基因組測(cè)序的方法來深入了解紫菜腐霉的遺傳信息，從而為開發(fā)赤腐病的防治策略打下基礎(chǔ)。

全基因測(cè)序在經(jīng)過第一代和第二代測(cè)序的強(qiáng)勢(shì)發(fā)展后，第三代測(cè)序技術(shù)開始登上測(cè)序舞臺(tái)并受到廣大研究者的青睞。目前的三代測(cè)序平臺(tái)主要有Pacific Biosciences(PacBio)公司的單分子實(shí)時(shí)(Single-molecule realtime，SMRT)測(cè)序技術(shù)、Oxford Nanopore公司的單分子納米孔測(cè)序技術(shù)(The single-molecule nanopore DNA sequencing)以及Helicos公司的真正單分子測(cè)序技術(shù)(True single-molecule sequencing，tSMSTM)，他們的共同特征就是基于單分子水平的邊合成邊測(cè)序。目前只有PacBio公司的實(shí)時(shí)單分子測(cè)序技術(shù)已經(jīng)商業(yè)化，其原理為當(dāng)正在合成的堿基與某個(gè)dNTP一致時(shí)，聚合酶緊緊捕獲具有特異熒光標(biāo)記的dNTP，這時(shí)激發(fā)光從ZMW(零模波導(dǎo)孔)的底部射出，被捕獲的dNTP就會(huì)發(fā)射熒光，儀器根據(jù)所拍到熒光的波長(zhǎng)與峰值判斷該堿基類型[5]。SMRT測(cè)序技術(shù)最主要的優(yōu)勢(shì)為其超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，升級(jí)后的SMRT測(cè)序技術(shù)平均讀長(zhǎng)可達(dá)到10～20 kb，最長(zhǎng)讀長(zhǎng)可超過40kb。這種超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)對(duì)后續(xù)的拼接、基因定位以及重復(fù)序列的測(cè)通起著重要作用。SMRT測(cè)序技術(shù)另外的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是GC偏好性很小，傳統(tǒng)建庫(kù)過程中一般都有大量的PCR過程，這導(dǎo)致GC含量高的區(qū)域被測(cè)到的次數(shù)較少，而SMRT技術(shù)在建庫(kù)過程中沒有PCR的過程，結(jié)合其超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的特征，可完成高GC基因組的測(cè)序，這一優(yōu)勢(shì)對(duì)一些高GC物種的基因組測(cè)序具有非常重要的意義。此外，SMRT測(cè)序技術(shù)可用于直接檢測(cè)表觀遺傳位點(diǎn)，在測(cè)序過程中，測(cè)序聚合物在遇到甲基化的堿基后，合成速度明顯放慢，同時(shí)光譜特征也會(huì)發(fā)生改變，由此可以判斷該DNA位點(diǎn)甲基化的類型[6]。

基于PacBio技術(shù)在全基因測(cè)序中的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛開始采用此項(xiàng)技術(shù)開展研究，但傳統(tǒng)方法制備的DNA樣品往往達(dá)不到PacBio技術(shù)對(duì)樣品的要求，因此獲得高質(zhì)量基因組 DNA樣品是開展后續(xù)測(cè)序的關(guān)鍵。針對(duì)不同物種細(xì)胞特性的差異和各種物種DNA中富含多糖、多酚等問題，人們通過對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法進(jìn)行改良，取得了很多成功方法[7-11]。紫菜腐霉基因組DNA中不僅富含多糖和蛋白質(zhì)，還具有嚴(yán)重的RNA污染，蛋白質(zhì)污染問題可通過增加酚/氯仿抽提次數(shù)來解決，而RNase A卻不能完全降解其中的RNA，即使延長(zhǎng)降解時(shí)間和增加降解次數(shù)依然無法完全降解其中的RNA污染。這種現(xiàn)象在其他物種中未見報(bào)道，因此沒有現(xiàn)成的純化方法可以借鑒。電洗脫法最初是運(yùn)用到T7噬菌體DNA酶切核苷酸片段的回收上[12]。本研究針對(duì)紫菜腐霉基因組DNA中存在的嚴(yán)重的RNA污染且通過RNase A 反復(fù)降解也無法獲得無RNA污染的高質(zhì)量的DNA樣品的問題，在電洗脫法和透析原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)出適合于紫菜腐霉基因組DNA樣品純化的方案。對(duì)純化后的DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)分析，并進(jìn)行PacBio文庫(kù)構(gòu)建和檢測(cè)。本研究希望為其在他物種在DNA樣品制備過程中遇到類似問題提供參考。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株

紫菜腐霉(P.porphyrae)于2013年5月購(gòu)自日本生物資源庫(kù)(Biological Resource Center)，紫菜腐霉菌株(NBRC33253)培養(yǎng)在玉米半海水培養(yǎng)基上(CMM)[13-14]。

1.2紫菜腐霉菌絲的擴(kuò)大培養(yǎng)和基因組DNA的制備

摳取培養(yǎng)在玉米半海水固體培養(yǎng)基上的菌餅，將其接種到谷氨酸鈉半海水液體培養(yǎng)基中[15]，23.5 ℃，100 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)5～7 d后收集菌絲，并用過濾的無菌海水沖洗3～5遍，用吸水紙吸干水分，并利用改良的CTAB法對(duì)其進(jìn)行基因組DNA提取[16]。

1.3紫菜腐霉基因組DNA的純化

透析袋使用前要經(jīng)過脫鹽和脫硫處理[17]，然后浸泡在TAE緩沖液中4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在瓊脂糖電泳分離基因組DNA和RNA之前，將1xTAE在4 ℃冰箱里預(yù)冷，瓊脂糖膠的濃度為0.8%，電泳過程的電壓降為2.5 V/cm，電泳2～3 h(電泳過程中可以在電泳槽的周圍放置冰袋為電泳液降溫，也可以在較低溫的環(huán)境下電泳)，電泳結(jié)束后，在紫外燈下迅速將基因組DNA條帶切下。接下來進(jìn)行電泳回收基因組DNA，具體步驟如下：

(1)用滅菌的蒸餾水對(duì)脫鹽、脫硫處理過的透析袋內(nèi)外壁進(jìn)行徹底清洗；

(2)先用透析夾將透析袋的一端夾緊，將上一步切下的含有紫菜腐霉基因組DNA片段的膠塊裝入透析袋，并灌入1x TAE電泳液，徹底排出其中的空氣后將另一端用透析夾夾緊；

(3)將裝配好的透析袋放入電泳槽中，保證電泳液沒過整個(gè)透析袋，電壓降為6 V/cm電泳1 h(注意透析袋的放置方向，保證膠塊中的DNA條帶走向與上一步電泳方向一致，同時(shí)注意電泳液的溫度盡量低溫)；

(4)電泳結(jié)束后將正負(fù)極對(duì)調(diào)電泳1 min，取出透析袋放入1L的TE緩沖液中透析，使袋中的乙酸透析出來，每2 h換一次新鮮的TE緩沖液，重復(fù)3～5次；

(5)將透析袋取出，打開一端的夾子將袋中的DNA溶液全部吸出，并用少量的TE緩沖液沖洗袋內(nèi)壁并和前面的DNA溶液混合到一塊；

(6)精確估量DNA溶液的體積，加入1/10倍體積(3 mol/L，pH=5.2)醋酸鈉溶液，混勻后加入2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，-20 ℃下沉淀過夜，4 ℃，13 000g離心10 min;

(7)棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次;

(8)室溫下干燥后(一般干燥5～15 min)，溶于適量的TE緩沖液中即為紫菜腐霉基因組DNA的TE溶液，-20℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4紫菜腐霉DNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)

分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop對(duì)DNA樣品的完整性和純度進(jìn)行初步檢測(cè)，同時(shí)利用脈沖場(chǎng)瓊脂糖電泳對(duì)DNA的完整性進(jìn)一步檢測(cè)；最后利用Qubit2.0精準(zhǔn)定量DNA的濃度和總量是否符合PacBio建庫(kù)要求。

進(jìn)一步對(duì)DNA進(jìn)行片段化(鑒于本試驗(yàn)中DNA樣品經(jīng)過反復(fù)的電泳和沉淀，DNA斷裂比較嚴(yán)重，故省略超聲波打斷DNA分子這一步)。利用核酸外切酶VII(ExoVII)對(duì)DNA片段兩端的單鏈部分進(jìn)行降解以形成平末端，利用Beyotime平末端修復(fù)試劑盒對(duì)DNA片段進(jìn)行損傷修復(fù)，最后利用AMPure PB beads對(duì)目的片段進(jìn)行富集(DNA片段的目標(biāo)長(zhǎng)度設(shè)置為10 kb)[18]。取1 μL 富集的DNA目的片段，利用安捷倫2100進(jìn)行片段長(zhǎng)度檢測(cè)。后續(xù)的添加接頭由PacBio測(cè)序平臺(tái)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1紫菜腐霉基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

CTAB法提取的基因組DNA經(jīng)檢測(cè)OD260/280 值在2.236～2.459之間，OD260/230 值在1.663～1.876之間(見表1)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣孔處有亮帶，基因組條帶前段有彌散(見圖1A)。DNA經(jīng)一次RNase A消化和蛋白質(zhì)抽提后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)點(diǎn)樣孔處亮帶消失，但是DNA條帶前面依然有彌散但亮度降低，DNA條帶的亮度也降低(見圖1B)。DNA經(jīng)3次RNase A消化和蛋白質(zhì)抽提后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因組DNA條帶前面依然有彌散但片段長(zhǎng)度降低，DNA條帶的亮度進(jìn)一步降低(見圖1C)。經(jīng)測(cè)定OD260/280 在2.092～2.168之間，OD260/230 值在2.000～2.015之間(見表1)。

表1 紫菜腐霉基因組DNA的吸光度值

較純DNA的OD260/280比值在1.8～2.0之間，大于2時(shí)說明有RNA污染，當(dāng)大于2.2時(shí)有RNA已經(jīng)水解成單核苷，230 nm處是其他碳水化合物如酚類、多糖的吸收峰，純凈的DNA的OD260/230比值應(yīng)大于2，當(dāng)DNA的OD260/230比值小于2時(shí)表明樣品被多糖和鹽類污染[19]。從DNA樣品的OD260/280 值在2.236～2.459之間，以及圖1-A中能明顯辨識(shí)出RNA的28s和18s條帶，我們推測(cè)基因組DNA樣品中有RNA污染。而OD260/230比值在1.663～1.876 之間，基因組DNA中可能存在多糖污染。經(jīng)過RNase A 的一次消化后DNA樣品中的部分RNA被降解，當(dāng)用RNase A對(duì)DNA反復(fù)的消化后，從OD260/280的比值在2.092～2.168之間，推測(cè)RNA污染問題基本解決，但是從OD260/230的比值在200.0～2.015之間推測(cè)DNA樣品并不存在嚴(yán)重的多糖污染，而圖1C分析認(rèn)為有可能是RNA污染，也有可能是多糖污染，還可能是二者共同存在。

(M: λDNA(50ng/μL);A: DNA初步檢測(cè)；B: 經(jīng)RNase A 消化后的DNA電泳檢測(cè)；C: 經(jīng)3次RNase A 消化后的DNA電泳檢測(cè)。A:preliminary test of DNA;B:Quality test of DNA which was digested by RNase A by agarose gel electrophoresis;C:Quality test of DNA which was digested three times by RNase by agarose gel electrophoresis.)

圖1 瓊脂糖電泳檢測(cè)紫菜腐霉絲狀體基因組DNA 質(zhì)量
Fig.1 Quality tests of genome DNA by agarose gel electrophoresis

2.2電洗脫和透析法純化基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè)

采用電洗脫和透析法純化紫菜腐霉基因組DNA后，通過脈沖場(chǎng)電泳對(duì)DNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，DNA片段多集中在10～20 kb之間(見圖2A)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，透析后的DNA經(jīng)電泳檢測(cè)點(diǎn)樣孔出沒有亮帶殘留，DNA條帶清晰完整(見圖2B)。用Nanodrop對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為ODA260/280為1.867～1.968，ODA260/230為2.000～2.015，濃度為110ng/μL (見表2)。用Qubit2.0進(jìn)行精準(zhǔn)定量，其濃度為80.15 ng/μL。Nanodrop測(cè)定DNA濃度和Qubit2.0測(cè)定的DNA濃度比為1.37。進(jìn)一步對(duì)DNA進(jìn)行損傷修復(fù)并對(duì)片段進(jìn)行富集，取1uL DNA修復(fù)片段利用安捷倫2100進(jìn)行核酸質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，在9.6 kb處出現(xiàn)峰圖，基本符合預(yù)期長(zhǎng)度10kb。

表2 紫菜腐霉基因組DNA透析后的吸光度值Table 2 Absorbance values of the P.porphyraegenome DNA afterbeing dialyze

(M1：Hind Ⅲ消化的λDNA;M2: λDNA(50 ng/μL); A : 透析后的DNA脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)；B：透析后的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。M1:λDNA after digesting by Hind Ⅲ;A:Quality test DNA after dialysis by PFGF;B:Quality test DNA after dialysis by AGE.)

圖2 紫菜腐霉基因組DNA透析純化后的脈沖場(chǎng)和瓊脂糖電泳檢測(cè)
Fig.2 Quality tests of genome DNA after being dialyze by AGE and PFGE

圖3 Agilent 2100 檢測(cè)DNA 片段質(zhì)量

3 討論

獲得高質(zhì)量基因組DNA樣品是進(jìn)行紫菜腐霉全基因組測(cè)序的關(guān)鍵。由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和基因表達(dá)活躍，導(dǎo)致基因組DNA中有豐富的RNA,利用RNase A去除RNA污染是首選措施，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNase A并不能徹底降解基因組中的RNA(見圖1A)，通過延長(zhǎng)RNA酶工作的時(shí)間和工作次數(shù)不僅不能完全降解其中的RNA，而且導(dǎo)致DNA總量損失嚴(yán)重(見圖1B、C)。分析認(rèn)為可能是細(xì)胞表達(dá)的某些特殊的多糖等次級(jí)代謝物與RNA片段結(jié)合并將其包裹，從而阻礙了RNase A與RNA的接觸，最終導(dǎo)致無法徹底去除DNA中的RNA，使得后續(xù)的測(cè)序工作無法進(jìn)行(在實(shí)驗(yàn)過程中嘗試著完成了PacBio文庫(kù)的構(gòu)建，但后續(xù)的測(cè)序工作無法進(jìn)行，浪費(fèi)了大量的時(shí)間和財(cái)力)。

反復(fù)的進(jìn)行RNA消化，殘留的RNA可能以RNA-RNA雙鏈的形式存在，于是嘗試?yán)肦Nase H對(duì)其進(jìn)行消化但依然無法解決問題，因此認(rèn)為紫菜腐霉DNA 中的RNA并沒有形成RNA-RNA雙鏈(結(jié)果沒有在文章中展示)。

透析(dialysis)是利用小分子可以經(jīng)過半透膜自由擴(kuò)散到水或緩沖液的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)，常用于蛋白質(zhì)的脫鹽純化過程[20]。本實(shí)驗(yàn)首先利用基因組DNA和RNA分子大小的差異性，通過瓊脂糖凝膠電泳有效分離DNA和RNA。其次，對(duì)獲得的DNA溶液中無機(jī)鹽離子通過透析的方法除去，從而獲得較純的DNA的TE溶液。在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意保持低電壓下電泳，以減少電泳引起的溫度升高對(duì)DNA的完整性造成的破壞。蛋白質(zhì)分子大小一般用質(zhì)量單位道爾頓(Dalton，Dr)表示，道爾頓是與分子量近似的單位(1Dalton=1/6.02×1023g)，在蛋白質(zhì)透析中常常通過目的蛋白質(zhì)分子大小來選擇透析袋的孔徑。由于在透析之前已經(jīng)通過電泳的方法將DNA和RNA分離，而透析袋的作用只是作為攔截DNA分子的過濾膜，而且基因組DNA分子量一般都很大，DNA分子直徑也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于需要透析出去的無機(jī)離子的直徑，只要保證透析袋的孔徑能夠攔截DNA分子即可，因此透析袋孔徑的選擇范圍比較寬泛[21]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看到，純化后的DNA無論從瓊脂糖電泳檢測(cè)還是經(jīng)脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)，DNA的質(zhì)量較高且符合PacBio建庫(kù)要求(OD260/280、OD260/230在1.8～2.0之間且Nanodrop測(cè)定濃度與Qubit測(cè)定濃度比為1.37<3)(此標(biāo)準(zhǔn)為PacBio測(cè)序平臺(tái)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)給出的建議和要求)。從回收率上，由于最開始的DNA中嚴(yán)重的RNA污染，我們無法準(zhǔn)確測(cè)定最初的DNA的濃度，只是通過基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶與Maker條帶的亮度比較的方法估讀了DNA的濃度。經(jīng)過電洗脫和透析后對(duì)DNA濃度進(jìn)行測(cè)定，通過計(jì)算回收率可達(dá)50%～60%。對(duì)于解決如此棘手的DNA問題，50%的回收率是可以接受的。本論文成文之際已經(jīng)完成了用此方法制備的紫菜腐霉菌絲DNA樣品的PacBio建庫(kù)和測(cè)序工作，測(cè)序片段的長(zhǎng)度平均達(dá)到8.7 kb,最長(zhǎng)的讀長(zhǎng)片段達(dá)到13kb(相關(guān)工作尚未發(fā)表)。這也證明了通過此方法純化的紫菜腐霉基因組DNA樣品可用于PacBio測(cè)序。

4 結(jié)語(yǔ)

本方法提供了一個(gè)通用、簡(jiǎn)單易行，成本低，且安全地去除紫菜腐霉基因組DNA 提取過程中的RNA污染的方法，所純化的 DNA純度較高且滿足于PacBio文庫(kù)建庫(kù)要求，為后續(xù)的建庫(kù)、測(cè)序提供了高質(zhì)量的DNA樣品，也為紫菜腐霉致病機(jī)理的研究奠定了重要的基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他物種在DNA制備中遇到類似的問題提供了參考方法。

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Abstract：PythiumPorphyraeis a special pathogen to infect Nori, which caused red rot disease inPyropiayezoensisfrequently. It brings seriously reduce in Nori production and quality every year in China, Korea and Japan. So, more genetic information about the pathogen could help us exploit disease prevention and control measures. The most useful and quickly method to get the genetic information is carrying on its whole genome analysis. High quality DNA sample is the key work for carrying on the project. Particular habitation and metabolism and abundant secondary metabolites in cells of marine organism often affects the quality of the genome DNA. TheP.porphyraegenome DNAwas polluted by RNA seriously in our preliminary experiment.Usually, RNA was easily degradation by RNase A, but the RNA which residual inP.porphyraegenome DNA was not removed absolutely, even by extending RNase A degradation time and increasingRNase A degradation times, RNA pollution in the DNA simple cannot be completely degradation,the DNAlost and degradation seriously, butthe DNA simple qualitystill cannot reach up to the standard for constructing PacBio libraries.The librarywhich was constructed mandatory cannot sequence normally. In this study, DNA was obtained by EDTA methods, then the agarosegel electrophoresis (AGE) was used to separate genome DNA and RNA.The DNA bandswere cut under UV light quickly andwere transferredinto dialysis bag, further electrophoresisto insure the direction of the DNA band migrating as before.Stopping electrophoresis after the DNA band disappeared from the agarose gelby checking under UV light. This result showed that the DNA in agarose gel had enteringto the TAE solution of the dialysis bag absolutely. The dialysis which contained DNA and agarose gel, was put into 1 liter of TE buffer, the sodium acetate (CH3COONa) in the dialysis would moved from the dialysis bag to the TE buffer. At last, the pure TE solution of DNAwas got eventually. Enriching DNA by anhydrous ethanol and then detecting the DNA by AGE and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The results showed that the DNA band was clearly, no RNA pollution and the DNA was integrity. It can be used for PacBio libraries constructing and sequencing.

Key wordsPythiumporphyrae; genome DNA; RNA pollution; electroelution; dialysis

責(zé)任編輯 高 蓓

The Applications of Electroelution and Dialysis to Purify Genome DNA ofPythiumporphyrae

ZOU Dan-Dan1,2, TANG Xiang-hai1，2， MO Zhao-Lan3， MAO Yun-Xiang1,2

(1. The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. College of Marine Life sciences Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Yellow Sea Fisheries Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

Q556.2

A

1672-5174(2017)11-047-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160302

鄒丹丹, 唐祥海, 莫照蘭, 等.電洗脫法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因組測(cè)序DNA樣品純化中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017, 47(11): 47-52.

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372517)；國(guó)家高技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A406)；山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)(2013CXC80202)資助 Supported by National Natural Science Foundation of China (31372517); National High Technology Research Projects (2012AA10A406);Independent Innovation Foundation of Shandong Province (2013CXC80202)

2016-09-01；

2016-11-22

鄒丹丹(1985-)，女，博士生。E-mail: zdcg2010@126.com

** 通訊作者：E-mail: yxmao@ouc.edu.cn