AHLs對小球藻PSⅡ光化學活性與生化指標的影響研究*

竇 勇， 甘 雨， 唐學璽， 張文慧， 姜智飛， 高金偉， 周文禮**

(1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384； 2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

AHLs對小球藻PSⅡ光化學活性與生化指標的影響研究*

竇 勇1， 甘 雨1， 唐學璽2， 張文慧1， 姜智飛1， 高金偉1， 周文禮1**

(1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384； 2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

小球藻是一種重要的資源微藻，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物能源和功能型保健食品等領域都有廣泛的應用。小球藻藻際共棲細菌產(chǎn)生的群感信號分子N-酰基-高絲氨酸內(nèi)酯類化合物(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)不僅可以調(diào)控細菌的生物學功能，還能影響藻類的生命活動，常會引起小球藻高密度培養(yǎng)系統(tǒng)崩潰，因此研究AHLs對小球藻生理代謝的影響和機理具有重要的現(xiàn)實意義。本研究采用批次培養(yǎng)的方法，研究了100、200、400 mmol/L C10-HSL(N-癸酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯)對普通海水小球藻(Chlorellavulgaris)PSⅡ光化學活性與生化指標(SOD、CAT、GPx和Mg2+-ATPase)的影響。結果顯示：在C10-HSL作用下，小球藻PSⅡ光化學活性指標——最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、實際光能轉(zhuǎn)化效率Yeild及表觀光合電子傳遞效率ETR均明顯下降，而且C10-HSL對Yeild的影響強于對Fv/Fm的作用；小球藻SOD、CAT、GPx和Mg2+-ATPase活性均大致呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但峰值出現(xiàn)時間不同，C10-HSL對生化指標的影響均未表現(xiàn)隨時間規(guī)律變化的劑量-效應關系。本研究闡明了AHLs對小球藻光合生理、抗氧化酶系統(tǒng)和能量代謝的影響規(guī)律，暗示AHLs引發(fā)的氧化損傷以及能量代謝紊亂可能是造成小球藻培養(yǎng)體系崩潰的重要原因，實驗結果為小球藻無菌化健康培養(yǎng)與養(yǎng)殖體系優(yōu)化提供了一定的依據(jù)。

AHLs；海水普通小球藻；光化學活性；生化指標

小球藻(Chlorella)是綠藻門的單細胞微藻，細胞內(nèi)氨基酸、維生素、多糖等含量豐富，它在水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物能源生產(chǎn)和功能型保健食品開發(fā)領域有廣泛的應用。在自然水體和室內(nèi)高密度培養(yǎng)體系中，藻際環(huán)境常存在著大量共棲細菌，這些細菌會產(chǎn)生一系列次級代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可以啟動細菌密度依賴的基因表達，使細菌產(chǎn)生獨特而多樣的生物學功能，這一現(xiàn)象稱為細菌的群感效應(Quorum Sensing, QS)，而介導群感效應的細菌代謝產(chǎn)物稱為群感信號物質(zhì)[3]，研究證實微生物的生物發(fā)光、聚集生長、胞外多糖的合成與分泌、生物膜的形成都受到群感信號分子的調(diào)控[4-7]。群感信號分子主要分為3類，其中N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類化合物(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)是革蘭氏陰性菌群感系統(tǒng)中最常見的信號物質(zhì)，AHLs家族成員眾多，其共同點是分子上都含有1個高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，不同的AHLs分子含有不同的?；ф溓揖哂胁煌纳锘钚訹8]，而目前的研究多集中于N-己酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C6-HSL)、N-酮己酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(OHHL)、N-辛酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C8-HSL)、N-癸酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C10-HSL)這幾種分子上[9-14]。

近年來的研究表明群感信號分子不僅能對細菌自身的生物學功能進行反饋調(diào)節(jié)，而且可以介導藻類-微生物的種間相互作用，徐魯燕等[15]發(fā)現(xiàn)某些海洋細菌產(chǎn)生的C6-HSL和C8-HSL顯著抑制了東海原甲藻、赤潮異彎藻生長；畢相東等[16]指出藻際異養(yǎng)菌產(chǎn)生的C6-HSL會誘導小球藻抗氧化酶系統(tǒng)應激表達，而另有學者[17-18]證實微藻能通過降解AHLs分子或合成AHLs類似物來干擾共棲細菌的胞間通訊。以往的工作多側(cè)重于AHLs某一方面的作用而缺乏系統(tǒng)性，本研究綜合考察了C10-HSL對C.vulgarisPSⅡ光化學活性、氧化應激和能量代謝的影響，探討了C.vulgaris對AHLs脅迫的響應機制，旨在為小球藻無菌化健康培養(yǎng)與養(yǎng)殖體系優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)條件

實驗用小球藻由中國海洋大學藻種室提供，采用f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(23±1)℃，光暗比12 h∶12 h，光強為60 μmol·m-2·s-1。培養(yǎng)期間每天搖瓶6次，防止微藻細胞附壁下沉。選取處于對數(shù)生長期的小球藻細胞進行實驗。

1.2 藥品與試劑

N-癸酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C10-HSL)標準品購自sigma公司，原藥溶于無水乙醇配制成1 mol/L的母液，于4℃保存，使用時根據(jù)實際情況加入無水乙醇稀釋配成具有濃度梯度的工作液，然后加入到不同處理組的小球藻培養(yǎng)液中，對照組(CK)藻液中僅加入無水乙醇。

1.3 實驗體系構建和分析指標系統(tǒng)

根據(jù)前期預實驗結果，將配制好的C10-HSL母液加入到處于對數(shù)生長期的100 mL小球藻培養(yǎng)液中，使其在培養(yǎng)液中的最終濃度為100、200、400 mmol/L，對照組按照1.2設置。每個實驗組設置3個平行，實驗重復3次。在實驗開始的0、1、2、3、4、5、6、7 d測定小球藻PSⅡ光化學活性——PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、PSⅡ的實際光能轉(zhuǎn)化效率(Yeild)、表觀光合電子傳遞效率(ETR)；生化指標——超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、Mg2+-ATP酶(Mg2+-ATPase)。

1.4 測定方法

1.4.1 小球藻PSⅡ光化學活性測定 使用德國Walz公司生產(chǎn)的IMAGING-PAM調(diào)制脈沖熒光儀測定PSⅡ光化學活性。向比色杯中依次加入3 mL蒸餾水和15 μL藻液，混勻，將樣品暗適應15 min，讀取Fv/Fm、Yeild和ETR數(shù)值。

1.4.2 小球藻生化指標測定 每次取樣時量取各處理組藻液40 mL在4℃下以6 000 r/min離心10 min，取沉淀藻泥加入3 mL生理鹽水，冰浴研磨，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，上清液用于生化指標測定。將SOD對超氧化物陰離子反應抑制率達到50%時定義為一個SOD酶活力單位，將每秒鐘每毫克組織蛋白分解1 μmol H2O2的量定義為一個CAT酶活力單位，將每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μmol NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADP定義為一個GPx單位，將1 h內(nèi)每毫克組織蛋白中ATP酶通過分解作用而產(chǎn)生1 μmol無機磷的量定義為一個Mg2+-ATP酶活力單位，以上四種酶活單位均為U/mgprot。所有酶活分析均采用比色法，吸光度值使用UV-1240紫外-可見分光光度計測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(mean±SE，n=3)表示。使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差one-way ANOVA分析，并采用LSD方法進行多重比較，顯著性水平α=0.05，標記*的處理組表示與對照組差異顯著(P<0.05)，反之差異不顯著(P>0.05)。

2 結果與分析

2.1 C10-HSL對小球藻PSⅡ光化學活性的影響

2.1.1 C10-HSL對小球藻Fv/Fm的影響Fv/Fm為最大量子產(chǎn)量，反映了植物PSII潛在最大光合能力，而環(huán)境條件改變時微藻Fv/Fm會發(fā)生顯著變化[19-20]。如圖1所示，隨著C10-HSL處理時間的延長小球藻Fv/Fm總體呈現(xiàn)下降趨勢，實驗前5天變化并不明顯，而從第6天開始顯著降低，至實驗結束時Fv/Fm達到最小值，此時100、200和400 mmol/L處理組Fv/Fm分別為0.41、0.49、0.52，較初始狀態(tài)分別減小36.92%、27.94%和21.21%。C10-HSL對小球藻Fv/Fm的影響隨時間變化表現(xiàn)不同的劑量-效應關系，實驗前2天小球藻Fv/Fm隨C10-HSL濃度的增加而降低，從第3天開始Fv/Fm隨C10-HSL濃度的增加而升高。

圖1 C10-HSL對小球藻Fv/Fm的影響

2.1.2 C10-HSL對小球藻Yeild的影響 Yeild為實際光化學量子產(chǎn)量，反映植物PSII在部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率。實驗期間小球藻Yeild波動較大無明顯規(guī)律(見圖2)，前2天Yeild緩慢降低，第3～5天維持相對穩(wěn)定，第6天顯著下降，而在第7天有所回升。C10-HSL對小球藻Yeild的影響隨時間變化表現(xiàn)不同的劑量-效應關系，實驗前2天微藻Yeild隨C10-HSL濃度的增加而降低，第3～5天 Yeild隨C10-HSL濃度的增加而升高，尤其是200和400 mmol/L處理組小球藻Yeild顯著高于對照(P<0.05)，而在實驗最后2天100和400 mmol/L處理組Yeild高于200 mmol/L處理組。

圖2 C10-HSL對小球藻Yeild的影響

2.1.3 C10-HSL對小球藻ETR的影響 ETR為表觀光合電子傳遞速率，是反映植物PSII反應中心活性與光合電子傳遞效率強弱的一個重要指標，其數(shù)值與光強、植物吸收入射光和能量分布比例以及光子通量密度有關[21]。小球藻ETR變化規(guī)律與Yeild大體一致，也隨時間呈“下降—穩(wěn)定—下降—回升”的波動趨勢(見圖3)。C10-HSL對小球藻ETR的影響隨時間表現(xiàn)出不同的劑量-效應關系，實驗初期C10-HSL處理組小球藻ETR均顯著低于對照組(P<0.05)，從第3天開始AHL對微藻ETR的刺激作用顯現(xiàn)，C10-HSL處理組的光合電子傳遞速率逐漸高于對照。實驗結束時100、200和400 mmol/L處理組小球藻ETR較初始狀態(tài)分別下降了 33.33%、40.91%和28.57%。

2.2 C10-HSL對小球藻生化指標的影響

2.2.1 C10-HSL對小球藻SOD活性的影響 實驗期間小球藻SOD活性呈先升高后降低的變化趨勢(見圖4)。實驗剛開始SOD就被大量誘導，從第3天起C10-HSL處理組微藻SOD活性均顯著高于對照組(P<0.05)，至第5天 100、200和400 mmol/L處理組酶活平均水平達到峰值49.37、55.03和61.67 U/mgprot，較初始階段分別上升了56.39%、76.95%和99.78%，但從第6天開始酶活力迅速回落，至實驗結束時各處理組小球藻SOD活性接近第2～3天的水平。C10-HSL對小球藻SOD的影響未表現(xiàn)出隨時間規(guī)律變化的劑量-效應關系，實驗第1、3、5天微藻SOD活力隨C10-HSL濃度增加而上升，實驗第7天酶活隨C10-HSL濃度增加而降低。

圖3 C10-HSL對小球藻ETR的影響

圖4 C10-HSL對小球藻SOD活力的影響

2.2.2 C10-HSL對小球藻CAT活性的影響 小球藻CAT活性的變化與SOD大體一致，也表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但在數(shù)值上略低于SOD(見圖5)。實驗開始微藻CAT活性便逐漸上升，從第3天起C10-HSL處理組酶活力均顯著高于對照組(P<0.05)，至第5天 100、200和400 mmol/L處理組酶活平均水平達到峰值41.27、49.70和53.27 U/mg prot，較初始階段分別上升了45.48%、72.98%和78.95%，但從第6天起酶活力迅速下降，至實驗結束時各C10-HSL處理組CAT活性平均值僅為峰值水平的86.83%、64.99%和61.95%。實驗第1、3、5天微藻CAT活性隨C10-HSL濃度增加而上升，其他時間C10-HSL對CAT的影響未表現(xiàn)出濃度依賴的劑量-效應關系。

圖5 C10-HSL對小球藻CAT活力的影響

2.2.3 C10-HSL對小球藻GPx活性的影響 實驗期間小球藻GPx活性呈先升高后降低的變化趨勢(見圖6)。實驗第1～4天，各C10-HSL處理組微藻GPx活性逐漸上升，至第4d時達到峰值，100、200和400 mmol/L處理組酶活平均水平分別為38.50、35.93和45.17 U/mgprot，從第5天起各處理組酶活力逐漸下降，至實驗結束時微藻GPx活性接近初期水平。實驗第1、3天小球藻GPx活性隨C10-HSL濃度增加而上升，實驗第6、7天酶活隨C10-HSL濃度增加而降低，其他時間C10-HSL對GPx的影響未表現(xiàn)出濃度依賴的劑量-效應關系。

圖6 C10-HSL對小球藻GPx活力的影響

2.2.4 C10-HSL對小球藻Mg2+-ATPase活性的影響 在C10-HSL作用下，小球藻Mg2+-ATPase活性表現(xiàn)出先升高后下降的變化規(guī)律(見圖7)。實驗初期Mg2+-ATPase活力便迅速上升，至第3天達到峰值，此時100、200和400 mmol/L處理組酶活平均水平分別為23.67、21.33和24.60 U/mgprot，從第4天起各處理組酶活力逐漸下降，至實驗結束時微藻GPx活性接近初始水平。C10-HSL對小球藻Mg2+-ATPase活性的影響未表現(xiàn)出隨時間變化的濃度依賴型特征，在第3天酶活力隨C10-HSL濃度增加而上升，實驗第6天酶活隨C10-HSL濃度增加而降低。

圖7 C10-HSL對小球藻Mg2+-ATPase活力的影響

3 討論

有文獻[22]指出，在正常狀態(tài)下藻類的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm值穩(wěn)定在0.65左右，當受到環(huán)境脅迫時該值會顯著下降，而在本研究中小球藻的Fv/Fm值處于0.41～0.63之間，表明C10-HSL對小球藻產(chǎn)生了較強的脅迫作用，在一定程度上抑制了微藻PSII的光化學活性。另外本實驗結果證實在C10-HSL脅迫下，小球藻Yeild的下降幅度超過Fv/Fm，暗示C10-HSL對微藻實際光合能力的影響強于對其最大光合潛力的作用。

SOD、CAT、GPx均為抗氧化酶，是生物體清除活性氧保護細胞免受氧化損傷的重要屏障[23]。在本研究中小球藻細胞內(nèi)3種抗氧化酶均被C10-HSL誘導表達，說明C10-HSL對微藻細胞施加了一定程度的氧化脅迫。Mg2+-ATPase是調(diào)節(jié)細胞能量代謝和離子轉(zhuǎn)運的關鍵酶，是維持生物體正常生理功能的重要物質(zhì)[24]。本實驗中小球藻Mg2+-ATPase活性波動劇烈，表明C10-HSL干擾了微藻細胞固有的ATP合成和離子運輸過程。由此可以推測，AHLs引發(fā)的氧化損傷以及能量代謝紊亂可能是共棲細菌造成小球藻高密度培養(yǎng)體系崩潰的重要原因。本研究中C10-HSL對SOD、CAT、GPx和Mg2+-ATPase的作用均為先誘導后抑制，這與其他學者[16]的結論有所不同，造成此種差異的原因可能與實驗中不同的AHLs分子結構以及脅迫濃度有關。

值得注意的是，AHLs家族的不同分子及處理濃度對其生物活性的發(fā)揮存在很大差異，畢相東[25]發(fā)現(xiàn)在400 nmol/L的C6-HSL脅迫下小球藻PSII的D1蛋白表達量顯著下調(diào)，而烯醇酶的表達量顯著上調(diào)，表明C6-HSL在損傷微藻細胞光合系統(tǒng)的同時加強了其厭氧呼吸速率，周麗娟等[26]證實10～80 μmol/L的α-氨基-γ-丁內(nèi)酯氫溴酸(AHLs的一種)可以明顯抑制銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)和集胞藻(Synechocystisp.)的生物量及蛋白表達，以上結果說明AHLs的生物活性取決于其分子結構、作用濃度及作用對象，因此摸索不同AHLs對資源微藻的生物活性差異有助于優(yōu)化微藻無菌化培養(yǎng)系統(tǒng)，同時也可為微藻的集約化健康培養(yǎng)提供參考。

有研究[8]表明AHLs介導的LuxI/LuxR雙元件系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌群感信號途徑的物質(zhì)基礎，該系統(tǒng)調(diào)控著微生物的種群動態(tài)和代謝生理，其中AHLs發(fā)揮了類似轉(zhuǎn)錄因子的作用，但目前AHLs影響藻類生理的機制尚不明晰，AHLs分子是否同樣作為轉(zhuǎn)錄因子類似物影響藻類相關基因的表達進而影響其生理代謝的強度和途徑的疑問至今未得到圓滿回答，所以在基因轉(zhuǎn)錄和表達水平上探討AHLs對藻類生理過程的作用機制應該作為未來研究的重要方向。

4 結論

(1)在100、200和400 mmol/L C10-HSL作用下，小球藻PSⅡ光化學活性指標——最大光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、實際光能轉(zhuǎn)化效率Yeild及表觀光合電子傳遞效率ETR均明顯下降，而且C10-HSL對Yeild的影響強于對Fv/Fm的作用；

(2)在C10-HSL作用下，小球藻SOD、CAT、GPx和Mg2+-ATPase活性均大致呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但峰值出現(xiàn)時間不同，C10-HSL對生化指標的影響均未表現(xiàn)隨時間規(guī)律變化的劑量-效應關系，濃度依賴型特征不突出。

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Abstract: As an excellent resource microalgae,Chlorellahas wide applications for aquaculture, production of biofuel and development of functional food. AHLs(N-acyl-homoserine lactones)are known as the quorum sensing signal molecule produced by commensalism bacteria in phycosphere. AHLs are playing important roles in not only regulating the biological function of bacteria, but also affecting the life activities of algae. Therefore, AHLs could result in the high-density culture system ofChlorellacollapse. A laboratory study was conducted to evaluate the effects of 100, 200, 400 mmol/LC10-HSL (N-decanoyl-L-homoserine lactones) on PSⅡ photochemistry activity, antioxidase(SOD, CAT, GPx) activities and energy metabolism enzyme Mg2+-ATPase activity of the marine microalgaeChlorellavulgaris, in the photoautotrophic culture process. The results were as follows: PSⅡ photochemistry activity indicators—Fv/Fm(maximal photochemical efficiency), Yeild (actual photochemical efficiency) and ETR (apparent photosynthetic electron transport ratio) decreased obviously under the effect of C10-HSL. C10-HSL exerted higher effect on Yeild thanFv/Fm. There was a same fluctuation trend of the enzymes activities of SOD, CAT,GPx and Mg2+-ATPase which increased first and then decreased, but the time of reaching peak was different. There was no regular dose-effect relationship of effect that exerted onC.vulgarisby C10-HSL over time. The concentration-dependent effect of C10-HSL onC.vulgariswas not obvious. The antioxidase activities ofC.vulgariswere induced expression in different extent, which meant the microalgae was subjected to oxidative stress exerted by C10-HSL. Mg2+-ATPase activity ofC.vulgarisfluctuated fiercely,which meant the process of ATP synthesis and ion transportation were disturbed by C10-HSL. The current research not only illuminated the changing discipline of PSⅡ photochemistry activity, antioxidase activities and energy metabolism enzyme activity ofChlorellavulgaris, but also implied that the oxidative damage and turbulence of energy metabolism were supposed to the important reasons for the collapse ofC.vulgarisdensity-culture system. The results provided a basis for the axenic culture and cultivation system optimization ofC.vulgaris.

Key words: AHLs; marineChlorellavulgaris; photochemistry activity; biochemical indexes

責任編輯 高 蓓

Effects of AHLs on PSⅡ Photochemistry Activity and Biochemical Indexes ofChlorellavulgaris

DOU Yong1, GAN Yu1, TANG Xue-Xi2, ZHANG Wen-Hui1, JIANG Zhi-Fei1, GAO Jin-Wei1,ZHOU Wen-Li1

(1.Tianjin Key Lab for Aquaculture Ecology and Cultivation, Fisheries College of Tianjin Agriculture University, Tianjin 300384, China; 2. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

X173

A

1672-5174(2017)11-040-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20170096

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天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目(ITTFRS2017005)；天津市科技重大專項與工程項目(15ZXBFNC00120)；衛(wèi)星海洋環(huán)境動力學國家重點實驗室開放基金項目(SOED1419)；農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室開放基金項目(FREU2015-04)資助 Supported by Innovation Team Program of Tianjin Fisheries Research System (ITTFRS2017005); Maior Science and Technology Project of Tianjin(15ZXBFNC00120); Fund of State Key Laboratory of Satellite Ocean Environment Dynamics(SOED1419); Fund of Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, P. R. China(FREU2015-04)

2017-04-18；

2017-06-13

竇 勇(1985-)，男，博士，講師，主要從事微藻生理生態(tài)學研究。E-mail: douyonghero@163.com

** 通訊作者：E-mail: saz0908@126.com