響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取干巴菌多糖工藝

張嵐，和勁松，王雪峰，廖國周，普岳紅，葛長榮，范江平，谷大海

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取干巴菌多糖工藝

張嵐，和勁松，王雪峰，廖國周，普岳紅，葛長榮，范江平*，谷大海*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

探討應(yīng)用復(fù)合酶法提取干巴菌多糖的最佳工藝條件。以多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化得出影響因素的最佳參數(shù)水平，進(jìn)而獲得最佳工藝條件。結(jié)果表明：復(fù)合酶法提取干巴菌多糖的最佳工藝條件為酶解時間64 min，料液比1∶40（mg/L），復(fù)合酶濃度0.47%，在此條件下干巴菌多糖提取率為17.87%，提取效果最優(yōu)。

干巴菌；多糖；復(fù)合酶法；響應(yīng)面分析法；工藝優(yōu)化

Abstract：The paper was aimed to study the optimal conditions for compound enzyme extraction of polysaccharides of Thelephora ganbajun Zang.The extraction rate of polysaccharides was main value index，based on single factor tests，the optimal parameters of influence factors were optimized by Box-Behnken design，and then the optimal conditions were obtained.The results showed that the optimal extraction conditions were hydrolysis time 64 min，material-liquid ratio 1∶40（mg/L），compound enzyme 0.47%.Under these conditions，the extraction rate of polysaccharides could be up to 17.87%，as well as show the optimal extraction results.

Key words：Thelephora ganbajun Zang；polysaccharide；compound enzymes methods；response surface analysis；processing optimization

多糖作為自然界中含量最多的天然聚合物之一，是生命物質(zhì)中重要的組成成分，由于其豐富的生物活性以及獨(dú)特的生理功能，多糖類化合物在醫(yī)藥、石化工業(yè)、環(huán)保工業(yè)以及食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，成為當(dāng)今國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。食用菌多糖因其具有純天然、無毒害、活性高等特點(diǎn)，擁有巨大的應(yīng)用價值和較為廣闊的市場前景[1-2]。

干巴菌又名繡球菌，也叫對花菌、馬牙菌等，屬于真菌門、層菌綱、褶菌目、革菌科，主產(chǎn)于云南，是一種珍稀名貴的食藥兩用真菌[3-4]。干巴菌主要分布在云南省昆明、呈貢、安寧、楚雄、保山等地，集中在海拔1 000 m～2 200 m的松林中，是野生食用菌中的上品。已有實(shí)驗證明，干巴菌的活性成分中，多糖含量較高，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效[5]。由于干巴菌季節(jié)性很強(qiáng)，為云南特有地方性食用菌，僅在云南省尤其是昆明以及其臨近地區(qū)有食用習(xí)慣[6]，因此，國內(nèi)外對干巴菌的研究極少，可能與原料的產(chǎn)地與產(chǎn)量較少有關(guān)。目前針對菌類多糖提取工藝的研究多采用傳統(tǒng)熱水法，多糖難以釋放出來，導(dǎo)致多糖得率較低[7]。而復(fù)合酶法可以最大限度的將植物組織分解，提高多糖得率；同時減少多糖結(jié)構(gòu)及生物活性的破壞，已逐漸成為植物活性成分提取工藝的研究熱點(diǎn)[8]。響應(yīng)面分析法是利用合理的試驗設(shè)計方案，通過對回歸方程的分析，優(yōu)化工藝參數(shù)的統(tǒng)計方法[9]。該方法設(shè)計合理，結(jié)果準(zhǔn)確，被越來越多的應(yīng)用于工藝優(yōu)化中。因此，本研究采用響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取干巴菌多糖工藝，考察各工藝參數(shù)對多糖得率的影響，旨在為干巴菌多糖活性的深入研究及其開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮干巴菌：云南易門康源菌業(yè)有限公司，干巴菌經(jīng)低溫干燥后，粉碎，備用。

纖維素酶、木瓜蛋白酶：Sangon Biotech公司；無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計：上海翱藝儀器有限公司；AR224CN電子天平：常州奧豪斯儀器有限公司；DKZ-1電熱恒溫水浴鍋：上海精密實(shí)驗設(shè)備有限公司；EU-K1-20TQ超純水器：南京歐鎧環(huán)境科技有限公司；TGC20M離心機(jī)：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；FW135型粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合酶法提取干巴菌多糖工藝

干巴菌原料進(jìn)行干燥粉碎，精確稱取過80目篩的干巴菌粉5 g，按照試驗設(shè)計，加入一定料液比及復(fù)合酶量，于設(shè)定溫度的水浴鍋中，不停攪拌，酶解反應(yīng)至設(shè)定時間，反應(yīng)結(jié)束后，置于沸水浴中滅酶10 min，離心待用。采用苯酚硫酸法[10]測定多糖含量，計算提取率。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]

稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200 mg，向其中加入蒸餾水使其溶解，定容至 100 mL。分別吸取標(biāo)液 2、4、6、8、10 mL，分別定容至100 mL。再吸取2 mL溶液，然后加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖5 min，置沸水浴上加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻30 min，以蒸餾水為空白作對照，在490 nm處用分光光度計測量吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=11.656x+0.025 8，R2=0.998 5。

1.3.3 干巴菌多糖提取率測定

精確吸取2 mL粗多糖溶液，然后加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖5 min，置沸水浴上加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻30 min，以蒸餾水為空白作對照，在490 nm處用分光光度計測量吸光度。根據(jù)葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品溶液的吸光度計算粗多糖提取率。多糖提取率計算式如下：

多糖提取率/%=[（C×V×d）/m]×100

式中：C為測得的樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品液體積，mL；d為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

在復(fù)合酶法提取干巴菌多糖過程中，影響多糖提取率最重要的因素為酶解時間、料液比、復(fù)合酶濃度。為研究以上因素對多糖提取率的影響規(guī)律，試驗對反應(yīng)條件進(jìn)行了設(shè)置。單因素試驗中，考察酶解時間（40、50、60、70、80 min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（mg/L）]復(fù)合酶選用（木瓜蛋白酶∶纖維素酶=2∶1）混合酶，考察酶加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對干巴菌多糖提取效果的影響。每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取復(fù)合酶酶解時間（A）、料液比（B）、復(fù)合酶濃度（C）3個對多糖提取率影響較顯著因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化干巴菌多糖提取工藝。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Design factors and levels of Box-Behnken experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗設(shè)計采用Design-Expert8.0統(tǒng)計分析軟件，圖形制作采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶解時間對干巴菌多糖提取率的影響

固定料液比1∶40（mg/L）、復(fù)合酶濃度0.5%、酶解溫度55℃，考察酶解時間對干巴菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，酶解時間在40 min～60 min范圍內(nèi)，干巴菌多糖的提取率隨時間的延長而增加，在60 min時，多糖提取率達(dá)到最大，說明酶解時間在60 min時，酶與底物充分反應(yīng)。因此，考慮到實(shí)際生產(chǎn)問題，選取60 min為最佳酶解時間。

2.1.2 料液比對干巴菌多糖提取率的影響

固定復(fù)合酶濃度0.5%、酶解溫度55℃，酶解時間60 min，考察料液比對干巴菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 酶解時間對干巴菌多糖提取率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides

圖2 料液比對干巴菌多糖提取率的影響Fig.2 Effect of marerial-liquid ratio on the yield of polysaccharides

由圖2可知，干巴菌多糖提取率在料液比為1∶10（mg/L）～1∶40（mg/L）時，提取率明顯增長，隨著液體量的增大，多糖提取率呈下降趨勢，說明在料液比為1∶40（mg/L）時，多糖已經(jīng)充分溶解到溶液中，繼續(xù)增大料液比可能會導(dǎo)致溶劑量過大而使有效成分流失。因此，選定料液比為1∶40（mg/L）為最佳料液比。

2.1.3 復(fù)合酶濃度對干巴菌多糖提取率的影響

固定料液比 1∶40（mg/L）、酶解溫度 55℃、酶解時間60 min，考察復(fù)合酶濃度對干巴菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 復(fù)合酶濃度對干巴菌多糖提取率的影響Fig.3 Effect of compound enzyme concentration on the yield of polysaccharides

在復(fù)合酶濃度為0.2%～0.5%的時候，多糖提取率隨酶濃度的增加而增長，在復(fù)合酶濃度達(dá)到0.5%以后，多糖提取率趨于平緩，這是由于，在一定酶解條件下，酶濃度不足時，酶濃度越大裂解細(xì)胞壁的效率越高，當(dāng)酶濃度到飽和后，再增加酶濃度對結(jié)果的影響就變?nèi)趿薣12]，因此，選取復(fù)合酶濃度為0.5%為最佳復(fù)合酶濃度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化干巴菌多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶解時間（A）、料液比（B）、復(fù)合酶濃度（C）作為試驗設(shè)計的3個自變量，通過響應(yīng)面試驗設(shè)計建立干巴菌多糖提取率與自變量直接的函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而尋求復(fù)合酶法提取干巴菌多糖的最佳提取工藝。用Design-Expert8.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 設(shè)計方案與試驗結(jié)果Table 2 Experimental design and yield

2.2.2 回歸模型的方差分析

回歸模型的方差分析[13]見表3。

表3 模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of analysis of variance of model

續(xù)表3 模型的方差分析結(jié)果Continue table 3 Analysis results of analysis of variance of model

由表3可知，模型對試驗擬合良好，模型的P值＜0.000 1，表明該試驗?zāi)Ｐ蜆O顯著。失擬項P=0.074 3＞0.05，說明失擬項檢驗不顯著，該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.979 7，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.959 4，說明方程對試驗的擬合度較好，能夠較真實(shí)地反應(yīng)試驗結(jié)果，可用此模型來分析和預(yù)測復(fù)合酶提取法提取干巴菌多糖的結(jié)果。對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到自變量與干巴菌多糖得率（Y）的二次多項回歸方程為：

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析[13]見圖4。

圖4 兩兩因素交互作用對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface for the effects of processing parameters on the extraction rate of polysaccharides

對模型的方差分析表明，響應(yīng)曲面越陡說明各因素之間兩兩交互作用越顯著，由圖4可以看出，C（復(fù)合酶濃度）與B（料液比）交互作用最為顯著；B（料液比）與A（酶解時間）；A（酶解時間）與C（復(fù)合酶濃度）次之，此結(jié)果與回歸分析結(jié)果吻合?？芍瑥?fù)合酶濃度對干巴菌多糖提取率的影響最為顯著。

由圖4可知，復(fù)合酶濃度與料液比對干巴菌多糖的影響均成拋物線形，即隨著復(fù)合酶濃度與料液比同時增加，多糖提取率呈現(xiàn)先增大后降低趨勢，所以，應(yīng)用到提取工藝中，可適當(dāng)增加復(fù)合酶濃度與料液比，可以提高干巴菌多糖提取率。而料液比對多糖的提取率的影響大于酶解時間，因為當(dāng)提取率達(dá)到平衡之前，原料與介質(zhì)之間的濃度差影響表觀速率常數(shù)，料液比數(shù)值越大，更有利于表觀速率常數(shù)維持在較大水平[14]，提高干巴菌多糖提取率。而適當(dāng)延長酶解時間可以提高干巴菌多糖提取率，但是酶解時間過長，會造成提取物自身的水解，或者造成大量目標(biāo)產(chǎn)物被吸附，從而導(dǎo)致干巴菌提取率下降。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)控制酶解時間在最佳范圍內(nèi)。

為檢驗響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取干巴菌多糖工藝的可靠性，采用優(yōu)化后的復(fù)合酶法提取工藝條件進(jìn)行驗證試驗，采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)，即酶解時間64 min，料液比 1∶40（mg/L），復(fù)合酶濃度 0.47%，在此條件下，干巴菌多糖提取率為17.55%，而模型預(yù)測值為17.87%。二者接近，表明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠[15]。

3 結(jié)論

本研究采用復(fù)合酶法提取干巴菌多糖，該工藝通過酶能使細(xì)胞壁破碎的作用，使細(xì)胞內(nèi)的多糖物質(zhì)可以充分溶出，從而顯著提高了干巴菌多糖的提取工藝。

為進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合酶法提取干巴菌多糖工藝條件，本試驗考察了酶解時間、料液比、復(fù)合酶濃度3個因素對干巴菌多糖提取率的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶法提取干巴菌多糖，得到多項式回歸方程，直觀體現(xiàn)了各試驗因素與試驗結(jié)果的相關(guān)性，影響干巴菌多糖提取率的工藝因素中，復(fù)合酶濃度對干巴菌多糖提取率的影響最為顯著。最終確定復(fù)合酶法提取干巴菌多糖的最佳工藝為酶解時間 64 min，料液比 1∶40（mg/L），復(fù)合酶濃度 0.47%，在此條件下干巴菌多糖得率為17.87%。而實(shí)測值為17.55%，試驗結(jié)果為干巴菌多糖的提取以及多糖性質(zhì)的研究提供了一定的試驗基礎(chǔ)，并能對工業(yè)化生產(chǎn)起到指導(dǎo)作用。

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Optimization of Compound Enzyme Extraction Technology of Polysaccharide of Thelephora ganbajun Zang via Response Surface Methodology

ZHANG Lan，HE Jin-song，WANG Xue-feng，LIAO Guo-zhou，PU Yue-hong，GE Chang-rong，F(xiàn)AN Jiang-ping*，GU Da-hai*
（College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Yunnan，China）

2017-03-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.010

云南省省院省?？萍己献鲗ｍ棧?013IB010）

張嵐（1988—），女（漢），碩士，研究方向：食品工程。

*通信作者：范江平（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品科學(xué)；谷大海（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程。